密度梯度离心基础

密度梯度离心基础余兴明中科院上海生物化学研究所概论转头选择密度梯度选用一、概论在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。在速率一区带离心中混合样品的以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份颗粒在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形成了数个含左第一级份颗粒的区带。离心过程在最垂的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉殿前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集，用常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。对于相类似的生物体组份常常形状也相似。在速率区带离心中我们常常使梯度液的最大密度不超过样品在该梯度中浮密度。利用这类生物组份在尺寸上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某一特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心即可以达到分离目的。与速率一区带离心法不同的是，等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一种方法依靠离心力来形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。对于速率一区带离心，梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；而等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。密度梯度离心法的理论依据是（参考文献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r式中V是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。σ：样品颗粒的密度（克/厘米3）s：密度梯度液的密度（克/厘米3）η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米·秒）ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）当σS时V0即样品顺离心力方向沉降σ〈S时V〈0即样品逆离心力方向上浮σ=S时V=0即样品停止沉降或上浮，稳定在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。二、转头的选择：1、离心转头分类：转头类别使用的离心机发明时间、发明者或推广商固定角式转头低、高、超速1943年，（英）Pickels甩平转头低、高、超速1951年，（德）Kahler垂直管转头高、超速1974-1975年，（美）Dupont公司区带转头低、高、超速1964-1965年，（英）Anderson、（英）MSE公司近垂直管转头超速1989年，（日）HitachiKoki、（美）Beckman公司连续离心转头低、高、超速1965年，（英）MSE公司其他特种转头：分析转头，土壤脱水转头，细胞浮选转头，管式转头，血球比测定转头，细胞清洗转头等等。2、各种转头用于密度梯度离心的比较：（I）各种转头用于速率一区带（R-z）离心的优缺点分析：固定角式转头：壁部放应影响很大，用于R-z离心回、收率低，纯度也受影响一般知用于差分离心和等密度离心，离心时间向较短。是各其离心机的最高速转头。甩平转头：细长离心管用于R-z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部入在很少。25000rpm~30000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离，而40000~42000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒草类物质内流的分离。离心时间较长。垂直管转头：沉降距离最短，因而离心分离时间也是短。最大半径前几乎没有壁部放位，最大本径后右一定壁部效位，垂直剖面积较大，因而离心后纯样品区带的容量也较大。但在有沉殿的密度梯度离心中，沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰，可能影响纯样品区带的纯度。大部份R-z离心没有沉殿，垂直管转头很适合做R-z离心。近垂直管转头：管轴线与旋转主轴之间倾角7度~9度（角式转头20度~45度）沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式，甩平转头都要短。由于右了倾角，沉殿可沿管壁滑向低部，因此基本上清除了沉殿与浮动区带转换之间的干扰，适合做R-z离心，特别适合做生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。区带转头：没有壁部入应特别适合做大容量的病毒，亚细胞器，生物大分子的R-z离心，可用于研究，中试和少批量生产。分离纯度高，量大，但操作要求高，转头及整体价格昂贵。连续流离心转头：工作原理的区带转头相似，可连续工作，分离量大，分离统纯度高，可用于各种生物体的差分，R-z等密度离心。近年来高速连续流转头常用于大量发酵液（大肠样菌、酝母菌）菌体的沉殿。（II）各种转头用于等密度离心内优缺点分析：固定角式转头：主要用于差分离心的角式转头，在速离心机上可以很好地用于等密度离心，尤其是DNA平衡等密度离心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的单管的容量为10~15ml,常用转速40000~60000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。甩平转头：用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较少，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。缺点是沉降距离长，最高转速较低（由于结构层固此类转头最主转速一般在60000rpm以下）因而，离心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量的转头最高转速在40000~41000rpm，用作自形成CSCL梯度的质粒DNA离心往往需要50~70小时。垂直管转头：适合作等密度离心，沉降距离最短，在没有沉殿或沉殿非常坚实的情况下，对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机，梯度转换得很好。这类转头转进很高（目前最高转速可达100000rpm，70000xg）离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积最大）。近垂直转头：九十年代以后开始使用的新型转头，用作生物大分子（DNA，RNA，蛋白质等）的平衡等密度离心最佳，目前这类转头的最高转速已达90000rpm近650000xg），离心时间相比垂直转头稍长。区带转头：非常适合做大容量样品的等密度离心连续流离心转头：高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心超速连续流转头适合做大容量样品的等密度离心分离。（三）密度梯度--材料和梯度型式的选用1、对于速率--区带密度梯度离心，梯心度选择要点（I）概述：用速率一区带法下简移尺R-z法进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离（比化样品，因此希望样品在沉降能通过整个离心管长度的提高分辨率。作为最基本条件就是梯度液的最大密度必须少于样品颗粒的密度。用有密度梯度的支持液作R-z离心有以下优点：*当样品中不同组份分层进入梯度液时，梯度的较高密度支持着样品这样就使样品各个不同密度的层次以较窄（或较薄）的区带沉降从而得到期较高的分辨率（或较高的纯度）*梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加，这样就可以稳定液栓，提示抗对和抗机械扰动的能力（接近离心过程结束时，纯样品区带和它的支持液的密度差较少）*梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠扰，提高了分离纯度。（II）梯度、材料的选用一个理想的梯液就具备：化学稳定性好；高溶合度；低渗透性；在溶剂中稳定性；较低的光吸收特性；价廉等。遗憾的是很难找到一种适合于各种R-z离心的完美无缺的梯度液。对于大参数R-z离心，蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度（30%W/N）时粘性每数较大，但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时（即使是低密度时也如此）右较高的渗透性，分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料，如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。在大多数情况下，梯度液的PH值应与被分离时生物样品的生理PH值一致。对密度梯度材料的基本要求：a）能够配制所需要的密度范围b）粘性系数较低c）溶合度高d）有密度与光折射率的对照资料e）对被分离样品无损害f）对被分离样品渗透很少g）在离分离完成后很容易与生物样品分离h）化学了性放稳定i）对离心过程中所接触的转头材料，离心管，管盖及密材料，连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用j）纯度高k）毒性少l）价格较低m）已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。常用的梯度材料有：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾、氯化铯、氯化铷、硫酸铷、三氯（耳苯酸钩、三氟醋酸铯、右旋糖苷，白蛋白、Ficoll,percoll,mettizamide,Nycodebnz,Ludox,Dextian等等（III）梯度形状的选择：所谓梯度形状是指梯度介质没着离尽管长充方向的密度变化特征。用于R-z离心密度梯度常用连续梯度也变是密度随着离心本径的增加而光滑地（不是实变化）增大，直线型的，光滑曲线型的（一般用凸指数或凹指数曲线，或凸凹指数曲线联用的）都属于连续梯度。不连续（阶梯型）梯度采用于等密度离心。*线型：在甩平转头中做R-z离心最常用线性梯度。制各线性梯度时要注意：（a）在甩平或垂直转头中制各线性梯度时，梯度液西的密度必须足支持样品，而底部密度必须少于被分离样品组份的密度。（b）一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率（c）蔗糖的常用线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V（d）可以用梯度议制各线性梯度，也可以人工辅设整个价梯型梯度，离心管二静置一致时间后也可以形成近线性梯度。*等运动梯度（等速梯度）（Isokinetic）等运动梯度是指在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。在做到等速沉降，必须使梯度和粘性力的增加与沿着离心本径方向的离心力增加相平衡，在这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间，离必力，以及颗粒本身的沉降多数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降分数，就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。在甩平转头中用等速沉降梯度时，从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。为了构造等速沉降梯度种慢必须注意到转头、离心管，梯度合质的密度，浓度和粘性系数在同一温度。在甩平转头中作蛋白质分离常用5~20%（W/V）的蔗糖梯度在5摄氏度离心可以达到近似的等速沉降的效果，而10~30%（W/V）的甘油梯度在5摄氏度时分离DNA或RNA也可以达到近似等速沉降的目的其他大金数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。*凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度：为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度，我们常常望梯度曲线在近度面处有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度，与比相反，如果液面处梯度液足以支持（托住）样品，故虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率（在高密度区）才能得到理想的分辨率，那么凹型指数曲线型梯度变能满足这个要求。*复合型梯度：如果用程序梯度仪来制备梯度，那么上节中的凸凹指数曲线梯度可以复合在同一梯度液中，这样的复合梯度在它们各自的区域保持了它们各自的优点。当然也制备其他类型的复合梯度。一般说，复合梯度多用于区带离心。（2）等密度离心，梯度要素的选择：（I）梯度材料及梯度溶液选择：所有的等密度离心都使用水溶性缓冲剂作溶剂，缓冲剂的组成及PH值取决于生物样品的性质。对细胞，亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。常用于等密度离心梯度材料有：材料名称DNARNA核蛋白膜亚细胞器细胞病毒蔗糖不适合不适合可用较好较好可用较好Ficoll不适合不适合不适合可用可用最佳较好CSCL最佳较好最佳不适合不适合不适合较好Percoll不适合不适合不适合可用较好较好可