实时荧光定量PCR注意事项及原理(Q-RT)

Quantitativereal-timePCR实时荧光定量PCR一、概述二、实验流程三、数据分析*四、疑难解答*一、概述常规PCR概念：扩增产物(扩增子)是通过终点法来分析检测，即PCR结束后，DNA通过琼脂凝胶电泳，然后进行成像分析。局限性：1.无法对起始模板准确定量，只能对终产物进行分析;2.对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高(相对误差1000%);3.存在扩增产物的污染问题；4.必须在扩增后用电泳方法进行分析，耗时费力而且EB有毒。5.无法对扩增反应实时监测。实时荧光定量PCR概念：在反应体系中加入荧光分子，利用荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，实时监测整个PCR过程。主要优点：1.能够实时监控PCR反应的进程;2.能够精确测定每个循环的扩增片段数量，从而对样本中的起始材料量进行准确定量;3.具有更大的检测动态范围;4.在单管中实现扩增和检测，无需PCR后处理。5.可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可用于定量(确定DNA拷贝数).荧光报告基团:双链DNA(dsDNA)结合染料：SYBRGreenI，非特异性结合在游离状态下,SYBRGreenI发出微弱的荧光,但一旦与dsDNA结合,其荧光增加1000倍。工作原理:x-轴表示PCR循环数；y-轴表示扩增反应的荧光值,与反应管中扩增产物的量有比例关系(28-40个循环)(1-18个循环)初始循环数阈值二、实验流程ExperimentalprocedureRNA样品的质量控制1.纯度检测：OD260/280分光光度法—是否有蛋白污染？比值在1.8~2.0之间则表示该RNA质量好，无蛋白和苯酚的污染。2.完整性检测：琼脂糖凝胶电泳检测大分子量的条带亮度是小分量的约2倍则表示RNA完整的。Marker28s(核糖体RNA)18s(rRNA)用模板初始量（或未知量样品的稀释倍数）的log值对每个稀释品的CT值作图，两者呈线性递减的关系，称之为标准曲线（至少5个数量级）。用来判定SYBRGreenI反应的效率、重复性和动态范围。标准曲线如果产物在每一循环都加倍，则荧光曲线之间的间距公式：2n=稀释倍数“n”为阈值线上扩增曲线之间的循环数，称为CT的差异。例如，10倍稀释的DNA样品，2n=10，n=log210=3.32，即CT值相差3.32个循环。[用作标准曲线的模板浓度范围必须涵盖所有待测样本模板浓度]n①R2显示实验数据符合回归曲线的程度，即数据的线性化程度。检测重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。优化的标准曲线：R20.980②扩增效率E应在90–110%之间。E=10-1/斜率y=-3.301x+38.591实时荧光定量PCR分析的部分实施需要经过优化以确保获得准确的结果。三、数据分析绝对定量相对定量绝对定量是测定靶点实际拷贝数的实时荧光定量PCR分析方法。需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量PCR扩增，利用获得的数据生成标准曲线。然后将未知样本的Ct值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数。绝对定量例如：10倍稀释已知浓度的标准曲线：得y=-3.301x+38.591或CT=-3.301(logquantity)+38.591未知样品的量Quantity=10(CT-38.591)/-3.301在相对定量中，通过归一化来确保相等数量的样品中比较目标基因的量。常用的是选择一个参照基因(如GAPDH，β-actin等)来进行相对定量，目的是弥补样本组织量的差异。用相对定量比较多个试验样本(test)，样本之一常被选为参照作为校准样品(calibrator)，所有样本中目标基因的表达都相对于参照上调或下调，无需精确测定拷贝数，而是关注与校准样本相比的倍数变化。相对定量例如，研究某一小麦基因在种子中的表达水平，取开花后5个时期样品进行实验反应板的制备内参基因标曲目标基因标曲标准曲线E在90–110%之间，R20.980，满足分析条件。用参照基因进行相对定量的方法有3种：1)Livak法，即2-△△Ct法;2)用参照基因的△Ct;3)Pfaffl法1)Livak法，即2-△△Ct法条件：目标基因和参照基因扩增效率都接近100%，且相互间效率偏差在5%以内。首先，用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值，△Ct(test)=Ct(target，test)-Ct(ref，test)△Ct(calibrator)=Ct(target，calibrator)-Ct(ref，calibrator)其次，用校准样本的△Ct值归一试验样本的△Ct值，△△Ct=△Ct(test)-△Ct(calibrator)最后，计算表达水平比率，2-△△Ct=表达量的比值分析：得到的结果是通过内参基因表达水平校准的试验样本中目标基因相对于校准样品的增加或减少的倍数。校准样品的表达水平相当于“1”。△Ct(calibrator)=△Ct(15d)=Ct(target，15d)-Ct(ref，15d)=25.42-20.39=5.03△Ct(test)=△Ct(10d)=Ct(target，10d)-Ct(ref，10d)=28.55-22.72=5.83△△Ct=△Ct(test)-△Ct(calibrator)=△Ct(10d)-△Ct(15d)=5.83-5.03=0.8表达量的比值=2-△△Ct=2-0.8=0.574352)用参照基因的△Ct是2-△△Ct法的一种变形，校准样品的表达水平不是“1”。首先，对所有样品的目标基因的表达量进行归一化，表达=2(Ct(ref)-Ct(target))若分析两个样本的比值(试验样品/校准样品)，则得到与2-△△Ct法一样的结果。10d样品：2(Ct(ref)-Ct(target))=2(22.72-28.55)=0.0175715d样品：2(Ct(ref)-Ct(target))=2(20.39-25.42)=0.0306915d表达=0.03069/0.03069=110d表达=0.01757/0.03069=0.572413)Pfaffl法适用于目标基因和参照基因的扩增效率不同，但目标和参照基因在试验样品和校准样品中有相同的扩增效率。(Etarget)△Ct，target(calibrator-test)Ratio=(Eref)△Ct，target(calibrator-test)四、疑难解答引物二聚体的形成当两个PCR引物(同义引物或正义和反义引物)相互结合，而非与靶点结合时，即形成引物二聚体。根据长度的不同，引物也可能出现自身折叠，由此与模板形成冲突。DNA结合染料的结合方式为非特异性的，由此可导致反应过程中监测到的荧光信号增强。这可相应改变Ct值，使结果出现偏差。A1:凝胶电泳是可显示引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100bp以下。在PCR过程中，二聚体的形成与模板的退火及延伸之间存在竞争作用。引物二聚体通常随模板的减少而增加。缺点：其灵敏度最低仅达到纳克级，因此可能无法得出结果。A2:采用熔解曲线分析可鉴别是否存在引物二聚体。如果扩增具有极好的特异性，则实时荧光定量PCR板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。引物二聚体的熔解温度较扩增片段更低，在70°C左右熔解。出现此峰形和熔解温度主要是由于引物二聚体的长度较小且不确定。NTC样品浓度低样品浓度高如果引物二聚体只是在NTC孔里出现，或者样本孔和NTC孔的ΔCt值的差异是大于10，来自引物二聚体的荧光信号可以忽略不计。A3:优化热循环条件，提高退火温度，减少或消除反应中的引物二聚体。A4:可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。A5:如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计。NTC扩增当引物二聚体形成时，如果使用与DNA双链结合的染料，在NTC反应中也可观察到荧光信号。另一种情况，在存在污染物的情况下，在NTC孔中也可看到晚期扩增。如果由于加样错误引起是一种随机事件，并不是所有NTC都会出现扩增。如果在每一个NTC反应里都出现扩增，很可能是其中一种或两种试剂被污染了。A1:使用干净的工作台，用带核酸降解试剂的的溶液擦抹工作台面。A2:用新的反应管尽量通过置换不同来源的试剂，发现出现问题的试剂。A3:在条件允许的情况下，在不同的实验地点建立反应，尤其是当应用质粒作为对照时(质粒可以被很容易扩散并且难以去掉)。A4:实验操作规范，避免加样错误。反应效率E过高或过低效率低于90%，其原因包括试剂浓度不适(如引物)，Tm以及热循环条件不适。因此，试管中各种源物质的竞争作用可造成反应效率低下。效率高于110%说明反应过程中存在抑制作用。引起抑制作用的原因包括RNA或DNA质量较差，模板浓度过高及含有核酸纯化的残余物(苯酚、乙醇)。A1:对于抑制作用，可去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线。如果效率重新回到110%以下，则分析良好。A4:通过分析优化可解决效率低下的问题。A2:重新纯化模板。延长干燥时间，以去除乙醇沉淀过程中的乙醇。A3:根据引物的Tm值，确保热循环条件(尤其是退火温度)适当，且引物设计时使之有相似的Tm值。待测样本反应结果在标准曲线的动态范围之外A1：重新构建覆盖待测样本模板浓度的标准曲线(改变稀释倍数)，分析并确保在新的动态范围内的线性。要求：用于作标准曲线的模板范围必须涵盖全部待测样本模板浓度，使得待测样本模板的扩增结果在实验的动态范围内。A2：如果待测样本的Ct值低于标准曲线上最高浓度的标准品的Ct值，稀释待测样本后重做实验。A3：如果待测样本的Ct值高于标准曲线上最低浓度的标准品的Ct值，增加待测样本量重做实验。例如：12345无扩增实验设计问题。引物未针对正确的靶点。检查序列数据库如NCBI搜寻目的基因的不同变异型。有可能实验设计知识针对了其中一种变异体，但是在所研究的样本里并无表达。反转录问题。检查您的反应中的各组分，通过优化各组分提高扩增效率。低表达。通常基因表达检测所需的cDNA量为1到100ng。但是如果目的基因的丰量的样本中很低，可能就需要更多的样本量。