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第2课时微生物的实验室培养土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分解纤维素的微生物的分离1、培养基的种类、营养要求及配制原则2、无菌技术的内容及方法3、分离纯化微生物的研究思路、方法一、培养基的营养构成1、微生物需要的五大类营养物质：碳源、氮源、生长因子、无机盐和水另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质（如:生长因子）以及氧气的要求。培养乳酸菌——添加维生素培养霉菌——PH调至酸性培养细菌——PH调至中性或微碱性培养厌氧微生物——无氧环境【特殊要求】定义作用主要来源碳源能提供碳元素的物质构成生物体的物质，异养生物的能源物质无机物：CO2、NaHCO3有机物：糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等异养微生物的碳源是有机物，最常利用的是糖类；自养微生物利用CO2或碳酸盐作为碳源（以无机碳源作为主要碳源）。定义作用主要来源氮源能提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物无机物：N2、NH3、氨盐、硝酸盐有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等能把氮气作为氮源的只限于固氮菌、某些放线菌和藻类等。霉菌仅以无机氮素化合物为氮源；部分细菌不用有机氮化合物作为氮源就不能生长。生长因子生长不可缺少的微量有机物酶和核酸的成分维生素、氨基酸、碱基等(1)微生物最常利用的碳源是糖类(特别是葡萄糖)，常利用的氮源是氨盐、硝酸盐。(2)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源。(3)微生物之所以需要补充生长因子，是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。【特别提醒】结果常用的方法消毒仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌二、消毒和灭菌培养基培养皿空气接种环双手牛奶②巴氏消毒③化学消毒⑤紫外线消毒⑥高压蒸气灭菌①灼烧灭菌④干热灭菌常用的消毒方法和灭菌方法无菌技术主要操作要求:①实验前应对操作空间、操作人员消毒，对所有器具和培养基灭菌。②实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作，另外要避免已灭菌处理材料再次污染。三、微生物实验室培养1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板2、微生物接种最常用的方法中的是：平板划线法和稀释涂布平板法如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。培养基的制作是否合格？平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。平板划线的操作方法为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？第一步：避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。1、根据培养基的用途可分为:四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基中加入某种化学物质，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长。选择培养基Q3:培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入_____________以纤维素作为唯一碳源的选择培养基，可以分离分解纤维素的微生物。Q1:分离利用石蜡油的微生物，用____________________的培养基Q2:分离产生蛋白酶的微生物，用___________________的培养基Q4:分离固氮微生物用______的培养基。以石蜡油作为唯一碳源以蛋白质作为唯一氮源青霉素缺氮鉴别培养基如：可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物。2、统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计一定容积的样品中微生物数量。②方法：用计数板计数。③缺点：不能区分死菌与活菌。四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(2)间接计数法(活菌计数法)①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。③计算公式：＝CV×M每克样品中的菌株数C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)M代表稀释倍数土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数3、细菌分离与计数的实验流程在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_____将尿素分解成了____。氨会使培养基的碱性_____，PH______。因此，我们可以通过检测培养基____变化来判断该化学反应是否发生。脲酶氨增强升高PH4、对分离的菌种的鉴定在以_____为唯一氮源的培养基中加入______指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变___，说明该细菌能够_________。尿素酚红红分解尿素4、对分离的菌种的鉴定1、纤维素酶五、分解纤维素的微生物的分离纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。纤维素纤维二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶(1)筛选纤维素分解菌的方法是__________该方法可以通过______反应直接筛选。刚果红染色法颜色2、纤维素分解菌的筛选原理(2)其原理是：刚果红可以与纤维素形成_________，当纤维素被________分解后，红色复合物无法形成，出现以___________为中心的______，我们可以通过_____________来筛选纤维素分解菌。红色复合物纤维素酶纤维素分解菌透明圈是否产生透明圈土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落3、分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是()A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B．富集培养这一步可省略；但培养纤维素分解菌少C．经稀释培养后，用刚果红染色D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上A【解析】经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色，设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物。【资料三】刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应方法二：在倒平板时就加入刚果红生物柴油油料作物植物油甲醇微生物M提取脂肪酶（2010·山东）生物柴油是一种可再生清洁能源，其应用在一定程度上能够缓人类对化石燃料的消耗。科学家发现，在微生物M产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油。（1）用于生产生物些油的植物油不易挥发，宜选用_______、_______方法从油料作物中提取。（2）筛选产脂肪酶的微生物M时，选择培养基中添加的植物油为微生物生长提供_______，培养基灭菌采用的最适方法是____________法。压榨萃取碳源高压蒸汽灭菌（3）测定培养液中微生物数量，可选用_____________法直接计数；从微生物M分离提取的脂肪酶通常需要检测__________，以确定其应用价值；为降低生产成本，可利用_________技术使脂肪酶能够重复使用。（4）若需克隆脂肪酶基因，可应用耐热DNA聚合酶催化的_________技术。显微镜直接计数酶活性固定化酶PCR2、某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了_______和_______。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是________和______。（2）为了使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。氮源碳源水无机盐无菌水（3）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。（4）如果要检测水中是否含有大肠杆菌，培养基中还应加入_______。多大(或严重)伊红—美蓝(2010年青岛市模拟)啤酒是我们日常生活中最常见的饮料之一。生产过程大致如下：将经过灭菌的麦芽汁充氧，接入啤酒酵母菌菌种后输入发酵罐。初期，酵母菌迅速繁殖，糖度下降，酒精浓度渐渐上升，泡沫不断增多；当糖度下降到一定程度后，结束发酵；最后分别输出有形物质和啤酒。根据上述过程，回答以下问题：(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意添加________________和调低pH，加琼脂后灭菌，制成固体平板。高浓度蔗糖(葡萄糖)步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。步骤4：根据_____________________筛选出突变菌。(2)上述步骤2、3的目的分别是____________________、___________________。(3)酿酒过程中，经检测活菌数量适宜但却不产生酒精，应采取的措施是__________。是否能在选择培养基上生长提供高糖和酸性筛选环境获得单菌落隔绝空气(4)秸秆的主要成分为木质素、纤维素和半纤维素，但是酵母菌却无法直接利用，原因是其_________________________。缺乏相应分解酶系(或缺乏纤维素酶和半纤维素酶)(2009年宁夏)(1)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_____(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和_____；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能______________。(2)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的________。灭菌消毒损伤DNA的结构比例合适(3)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_____。(4)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_______________。鉴定将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生(5)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_____处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。灭菌