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第八章酵母基因工程主要内容第一节酵母基因工程表达体系酵母基因表达宿主系统酵母菌表达载体酵母菌的转化系统第二节常见的酵母基因表达系统第三节影响外源基因表达的因素第四节酵母基因工程应用举例第一节酵母基因表达体系——宿主系统•酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类，共由56个属和500多个种组成。•酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求①安全无毒，没有致病性。②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。④培养条件简单，容易进行高密度发酵。⑤有较强的蛋白质分泌能力。⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。酵母菌表达外源基因的优势①全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便②能将外源基因表达产物分泌至培养基中③具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统④大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉⑤不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统⑥酵母菌是最简单的真核模式生物常用的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：•酿酒酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）•克鲁维酵亚母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）•假丝酵母属如产朊假丝酵母(Candidautilis)•毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）•裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。酵母菌表达宿主系统（1）酿酒酵母优点：①酿酒酵母长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安全性好，已被FDA认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验②生长迅速，工艺简单，成本低③是真核生物，可以对蛋白进行翻译后加工④表达产物可分泌表达，易于纯化⑤遗传背景清楚，易进行操作酵母菌表达宿主系统酿酒酵母的缺点：①发酵时会产生乙醇，难以进行高密度发酵，直接导致外源基因很难达到很高的水平②缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌的蛋白质能力较差③酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌④表达菌株传代不稳定，表达质粒易丢失⑤分泌效率低，大于30KD的蛋白质几乎不分泌酵母菌表达宿主系统（2）乳酸克鲁维酵母表达系统•可以高密度发酵，不需要甲醇防爆装置，工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再繁殖能力。•乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。•乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。酵母菌表达宿主系统（3）产朊假丝酵母•食品及药品工业的安全生物•不具有酵解抑制有氧氧化效应，因而在严格好气的条件下不会产生乙醇•发酵密度高，在高密度发酵中细胞干重可以达到92g/L•在廉价的糖蜜中就能生产，成本低酵母菌表达宿主系统（4）栗酒裂殖酵母裂殖酵母是子囊菌真核单细胞生物，是一类不能出芽生殖而只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母。与其他酵母相比，它具有更多的与高等真核生物相似的特性：线粒体结构，启动子结构，转录机制，对蛋白N-端乙酰化功能均更接近于哺乳动物细胞。已有多种蛋白利用此系统进行了表达，如人蛋白凝血因子VIIIa，人白细胞介素IL-6等。酵母菌表达宿主系统（5）巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。表达系统优势：•生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表达。•由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。酵母表达载体•酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（shuttlevector）。•酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。酵母表达载体1．酵母载体的基本结构•DNA复制起始区：通常来自于2μ质粒的复制起始区及酵母基因组的自主复制序列•筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选•整合介导区:能有效介导载体与宿主之间发生同源重组•有丝分裂稳定区•表达盒：启动子，分泌信号序列，终止子酵母表达载体酿酒酵母中的2μ环状质粒•环状质粒，拷贝数达50至100个。•IRs反向重复序列，600bp•FLP编码产物驱动IRs的同源重组•REP编码产物控制质粒的稳定性•STBREP的结合位点•接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质粒类似。酵母表达载体2．酵母载体的种类•酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类•酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分为下列五类：①酵母整合型质粒YIp②酵母附加体质粒YEp③酵母复制型质粒YRp④酵母着丝粒质粒YCp⑤酵母人工染色体YAC酵母表达载体（1）酵母整合型质粒YIp：缺乏酵母的复制起始位点，不能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记ura3基因。具有整合介导区，所以，它只有整合到酵母染色体中才能稳定。•含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建•在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。酵母表达载体（2）酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2μ质粒DNA复制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高。（3）酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个。•ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。•以ARS为复制子的质粒称为YRp，以2μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp•上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。酵母表达载体（4）酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CENDNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp.YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。酵母表达载体（5）酵母人工染色体YAC：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。•YAC具有自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YAC载体在宿主细胞中以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可接受100-1000kb的外源DNA片段。酵母表达载体YAC主要结构：•①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；•②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；•③一个自主复制序列(ARS1)；•④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；•⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；•⑥Ampr抗性及细菌质粒复制原点；•⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。酵母菌转化方法•原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可达原生质体总数的1-2%。•Li+盐转化方法：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤酵母转化一般用氯化锂有效•优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）酵母菌转化方法•电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入•优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围广；转化率高（达105/μgDNA）。•PEG转化法：PEG1000聚乙二醇英文名polyethyleneglycol化学结构：酵母菌转化方法用于转化子筛选的标记基因(1)营养缺陷型的互补基因•营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难(2)显性标记基因——其编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白酵母菌转化方法:显性标记基因标记基因编码产物遗传表型aph氨基糖苷转移酶抗G418cat氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1铜离子螯合物耐受铜离子suc2蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂第二节常见的酵母基因表达系统一、酿酒酵母表达系统1．启动子•组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子•可控性启动子：半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸酶启动子（PHO）、乙醇脱氢酶（ADH2）启动子、Cu2+螯合蛋白启动子（CUPI）以及交配a型阻遏系统（MATa/a）酿酒酵母表达载体•目前已建立的酿酒酵母表达载体有（1）酵母附加体质粒(YEp)（见右图）；（2）酵母复制型质粒(YRp)；（3）酵母着丝粒质粒(YCp)；（4）酵母整合型质粒(YIp)；（5）酵母人工染色体(YAC)。•前三类统称为游离自主复制型质粒载体。含有来自酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2μ复制起点序列，能够自主复制，通常为多拷贝数酿酒酵母宿主——突变株•有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。如pep4-3突变株中蛋白酶的活性显著降低，对外源基因表达产物的降解作用较小。•为了减少目的蛋白的过度糖基化，目前已从野生型的酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突变株、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的alg突变株以及外侧糖链缺陷型的och突变株等。在这些突变株中，具有重要实用价值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链。提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌突变类型生物效应作用位点ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yssc2提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1提高重组蛋白表达转录水平rho-提高重组蛋白表达转录水平抑制超糖基化作用的突变宿主菌•许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链