基因测序及分析

基因测序及分析基因测序及分析人类基因组线粒体基因组(16.6kb) 核基因组(3200Mb) 基因外序列基因和基因有关序列约10% 约90% 专一或中等重复序列 Non­coding DNA 假基因内含子基因片段 10% 90% 专一的或低拷贝数序列中度至高度重复序列 20~30% 70~80% 分散重复序列串联重复序列/ 成簇重复序列约60% 约40% 蛋白编码基因 rRNA 基因 tRNA 基因 Coding DNA序列测定的技术Ø杂交测序法Ø质谱法Ø单分子测序法Ø原子探针显微镜测序法ØDNA 芯片法经典方法: Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) Maxam­Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977) 新技术方法:• 与 PCR反应类似。 • 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； • 反应过程：变性－复性－延伸－终止 Sanger双脱氧终止法Dideoxynucleotides （双脱氧核苷酸） • ddNTPs 是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 • 反应体系中dNTPs的浓度远高于 ddNTPs(一般1：3~4)。* 少一个－OH 少一个－OH 脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较Sanger第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快ddNTPs参与下的DNA复制Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物； “标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。Sanger第二步：荧光检测Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination • DNA带负电 • DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关Analyzed Raw Data • 除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。 • Trace diagrams are analyzed by base calling programs that use dynamic programming to match predicted and occurring peak intensity and peak location. • Base calling programs predict nucleotide locations in sequencing reads where data anomalies occur. Such as multiple peaks at one nucleotide location, spread out peaks, low intensity peaks.Maxam-Gilbert法一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。碱基特异性化学切割反应： • 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N 7 原子甲基化。 • 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。 • 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。• G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 • G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和 G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使 A、G脱落。 • T+C反应：肼（低盐） • C反应：肼（高盐）测定DNA长度~250bp。化学裂解法测定DNA的核苷酸序列杂交法SBH（Sequencingbyhybridization） • 用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸探针与未知序列的DNA片段杂交。根据某些探针形成的完全双链，推知目的DNA的碱基序列。基因组测序在大规模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个bp。现在还不能直接测定整个分子的序列，然而，可以得到待测序列的一系列序列片段。序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信息。序列片段的长度范围300－1000bp，而目标序列的长度范围是3~100万bp，总的片段数目可达上千个。DNA序列片段组装（sequenceassembly)，又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序列也就得到了。• DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化，构建基因组的物理图谱。 • 先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群”(contig)。选取有关的克隆进行DNA测序，就可以“拼装”出整个染色体或基因组的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接测序，则需通过亚克隆，构建更小的片段。 • 另外一种方法是对所有相互重叠的亚克隆进行测序，然后直接通过计算机程序根据其重叠部分进行 “拼装”。完整基因组的测序过程一般包括三个步骤：（1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（YeastArtificialChromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（BacterialArtificialChromosome）克隆等；（2）利用鸟枪法（ShotgunStrategy）测定每个克隆的序列；（3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。鸟枪测序法(shotgunsequencing)大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体（如M13噬菌体）；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。将DNA大片段切割成小片段的三种方法：限制性内切酶超声波处理DNA酶I降解(加Mn2+)在这三种方法处理前，DNA的纯化非常重要，要去除载体DNA或仅由载体DNA产生的片段。DNA全序列切成小段小段和载体结合结合后进行测序Map fragments Sequence overlapping fragments Assembled sequence 基因组DNA序列测定示意图通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过 “拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装”。 Sequence all fragments and assemble鸟枪法测序的缺点 • 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。 • 高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。引物步移策略将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。定向缺失克隆策略、染色体步查法等。