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原理利用强变性剂异硫氰酸胍迅速裂解组织（或细胞），促使核蛋白与核酸的解离，并迅速抑制细胞内的RNA酶；经酸性苯酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀可获得完整的RNA。的塑料制品，如果没有开封使用过，可以直接使用。对于国产塑料制品，都必须处理方可使用，步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入双蒸水，加入DEPC使其终浓度为0.1%，磁力搅拌0.5小时；2）用1）浸泡需要处理的塑料制品，在通风橱中处理过夜；3）弃将DEPC水，用铝箔封住处理过的塑料制品，高温高压灭菌至少30min；5）100℃烤至干燥，置于干净处备用。枪头必须在无菌操作台中，用镊子装入枪头盒。玻璃和金属制品的处理用去离子清洗干净，用锡箔纸包好，然后至烘箱中250℃烘烤3小时以上或者180℃烘烤8小时以上。1.1.2.3电泳槽的处理用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，最后用0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。酶很难被灭活，实验过程中要时刻注意防止RNA酶污染。实验操作者的手也是RNA酶最主要的潜在污染源之一，因此，在实验准备和RNA抽提过程中，都应戴手套，并尽可能勤换手套。实验室RNA相关实验用的仪器及试剂应该专用，包括移液器、玻璃器皿、塑料制品和电泳槽等，并存放在指定地点。，冰上充分研磨至看不见块状的组织，再补加900ulTrizol至1ml（适用肝、肾等组织）悬浮细胞贴壁细胞细胞液氮研磨棒组织倾去培养基，按10cmdish/ml的比例直接将Trizol加入到培养皿中消化、裂解细胞，用RNAsefree的枪头吹打数次，将样品转入无RNA酶的EP管中用液氮预冷研钵，将绿豆大小的组织直接置于液氮中敲碎，并迅速研磨至粉末状，小心转移至1mlTrizol中。在研磨的过程中，应不断补加液氮，直至样品成粉末状（适用于心、胃、主动脉等组织）4℃2000g离心5分钟收集细胞，用Trizol重悬、裂解，每1mlTrizol可裂解5-10*106个细胞相分离（1）匀浆好的组织，室温下静置5-10min以充分裂解，4℃、16000rpm离心10min，取800微升上清液转入一个无RNA酶的EP管中；若为细胞样本，可以省略此步，直接进行下一步操作；（2）按照1mlTrizol加入200µl氯仿，用手剧烈振荡混匀15-30S后室温静置10-15min，直至出现较为明显的分层；（3）4℃，16000r/min离心15min，小心吸取上层水相于一新管。*千万不可吸取到中间界面，一般吸取300微升上清，所得RNA产量足以进行一般的后续实验，过多上清很容易造成DNA污染；沉淀(4)加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；(5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清，此时可见RNA沉淀于管底。在离心之前，RNA沉淀是不可见的，常常在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球；（6）加入1ml75%DEPC-乙醇，悬浮沉淀；*此步一定要将RNA沉淀悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去（7）4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温晾干，或者真空干燥5~10min，视沉淀量的多少加入DEPC-ddH2O溶解RNA，可用枪吹打数下以助RNA溶解；*沉淀不要过于干燥，否则将会大大降低RNA的溶解度；1.1.3.4RNA洗涤、溶解质量检测（1）完整性：可以用普通琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。电泳所用的缓冲液必须是新配置的。如果电泳可见28S和18S两条主要条带，以及5S的带，并且28S的亮度在18S的两倍以上，认为RNA的质量很好。*RNA上样量应控制在300-400ng左右，过多或过少都影响电泳效果质量检测（2）纯度和产量分析：计算A260/A280的比值R来判定RNA的纯度：用DEPC-ddH2O溶解RNA，1.6R1.8，认为RNA的质量较好；R1.6时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显；R1.8时，说明RNA降解比较明显。根据1A260单链RNA=40ng/ul计算RNA产量。标本编号，贴标签，置于-80℃保存。做好RNA标本的贮存登记、RNA提取实验记录、RNA质量鉴定记录等，并由专人统一保管。（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去污剂SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性，通过酚－氯仿法去除蛋白质，而保留DNA于水相溶液，最后通过无水乙醇和高盐溶液沉淀基因组DNA。微升裂解液，充分研磨至看不见块状的组织，再补加900ul裂解液至1ml（适用肝、肾等组织），55℃裂解过夜悬浮细胞贴壁细胞细胞液氮研磨棒组织倾去培养基除，PBS洗涤细胞1-2次，按10cmdish/ml的比例直接将裂解液加入到培养皿中消化细胞，用枪头吹落细胞，转入EP管中55℃裂解过夜取黄豆大小的组织于盛有液氮的研钵内迅速研磨至粉末状。在研磨的过程中，不断补加液氮，直至样品成粉末状（适用于心、胃等组织），将其小心转入装有1ml裂解液的EP管中，55℃裂解过夜；4℃2000g离心5分钟收集细胞，PBS重悬浮洗涤细胞，按照1-5*107的比例加入裂解液，悬浮细胞，55℃裂解过夜；抽提步骤（2）匀浆裂解过夜的样本应清亮透明。加入等体积Tris-饱和酚，轻轻颠倒，充分混匀形成乳浊液，此步将离心管置于旋转器上，慢慢混匀10-30min；（3）室温，12000rpm，离心10min，取上清；（4）加入等体积的酚-氯仿，轻轻颠倒混匀；（5）室温，12000rpm，离心15min，小心取出上清；抽提步骤（6）加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，此时可见絮状沉淀析出，置-80℃冰箱30min；（7）12000rpm离心15min，小心倾去上清；（8）加入1ml70%乙醇，悬浮沉淀；（9）4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温晾干5-10min，视沉淀量的多少加入灭菌双蒸水溶解DNA沉淀。倍（使OD260值位于0.1~1.0之间），检测样品的OD260，OD280，计算其比值R来衡量样品的纯度。一般R≈1.8，DNA质量较好；R＞2.0,表明RNA污染明显；R＜1.7，表明蛋白质、酚等污染较为明显。根据1A260双链DNA=50ng/ul，计算DNA产量。质检过关的DNA，若短期内需要进行下一步实验，可以暂存区-20℃，长期保存则应置于-80℃。做好样本贮存登记、具体的实验记录、质量鉴定记录等，并由专人统一保管。1.2.4DNA保存的强阴离子洗涤剂中，细胞壁破裂，染色体DNA及蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，被SDS所包围，当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中进一步有效地沉淀下来，通过离心去除，利用异丙醇沉淀从上清中获得质粒DNA。的抽提步骤菌夜重悬裂解沉淀，洗涤，溶解质粒复性，蛋白沉淀氯仿抽提质量检测、取2ml过夜培养的菌夜于EP管中，4℃，离心收集菌沉淀；2、将细菌沉淀重悬于200μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀；*一定要使细菌分散均匀3、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，轻轻颠倒数次混匀（不可剧烈振荡），并将离心管置冰上2-3min，使细胞壁充分裂解（离心管中菌液逐渐变得透明且粘稠）；*此步时间不宜过长，混匀不能剧烈，否则基因组DNA断裂，造成污染4、加入200μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min；、加入500μl的氯仿，混匀，4℃，12000rpm离心10min；7、小心移去上请，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，室温放置5min，4℃，12000rpm离心15min，可见质粒DNA沉淀；8、小心弃上清，1ml预冷的70%乙醇悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5min，重复此步一次；9、室温干燥沉淀5-10min，视沉淀多少加入灭菌ddH2O溶解沉淀倍，检测样品的OD260和OD280，计算其比值R来衡量样品的纯度。一般认为R≈1.8,DNA质量较好；R＞2.0，表明RNA污染明显；R＜1.7，表明蛋白质、酚等污染较为明显。根据1A260双链DNA=50ng/ul，计算质粒DNA产量。质检过关的质粒，若短期内需要进行下一步实验，可以暂存区-20℃，长期保存则应置于-80℃。做好质粒样本贮存登记、具体的实验记录、质量鉴定记录等，并由专人统一保管。1.3.4质粒DNA的保存、PCR技术2.1原理实验操作要求在三个不同的区域内进行，严格预防PCR的污染：1、标本处理区，包括扩增模版的制备；2、PCR扩增区，包括PCR反应液的配置和PCR扩增；3、PCR产物分析区，包括凝胶电泳分析，拍照及胶回收等。各工作区必须有一定的隔离，各区实验器材需专用，并且各区设置要有一定的方向性：标本制备—PCR扩增—产物分析—产物处理。切记PCR扩增产物及产物分析区的器材不要拿到标本处理区和PCR扩增区。×PCRbuffer5μldNTPMix(各2.5mM)4μl引物P1（10mM）1μl引物P2（10mM）1μl模板*Xμl酶（5U/μl）0.5μl灭菌双蒸水upto50μl2.3.150μl标准PCR反应体系