葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法

葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。设不加样品时，测得的吸光度为c0,加样品后测的吸光度为c1.那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。一实验试剂：α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖)均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等,均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。二实验器材：BioTek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器三实验方法：（一）试剂配制（1）pH值6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液分别配制0.1mol/LNa2HPO4和KH2PO4(13.6g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH值至6.8即得0.1mol/L磷酸缓冲液（2）用pH值6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液配制0.26U/mlα-Glucosidase（3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5mmol/L(1.505mg/ml)（4）反应终止液：0.2mol/LNa2CO3。（5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10mg/ml的浓度。（二）实验方法1.各浓度药液按每孔50μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50μL0.26U/mL的-葡萄糖苷酶，其他组加50μL磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为：药物反应孔：50μL药液+50μL酶药物对照孔：50μL药液+50μL磷酸缓冲液空白反应孔：50μL磷酸缓冲液+50μL酶空白对照孔：50μL磷酸缓冲液+50μL磷酸缓冲液上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37oC水浴中孵育10min。2.每孔加100μl底物（5mmol/L的PNPG,15mg配成10ml）后，在微型振荡器上震荡30s，在恒温水浴锅中37℃孵育20min。3.每孔加入100μl0.2mol/LNa2CO3终止反应(1.06g配成50ml)。在酶标仪405nm处测定OD值。4.计算公式：抑制率（%）=[1-(药物反应孔OD值-药物对照孔OD值)/（空白反应OD值-空白对照OD值）]×100每个样品活性测试三次，活性结果去平均值，并计算相对标准偏差。通过相对标准偏差来反应实验的重复性和精密度，偏差越小，说明实验重复性和精确度越好