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实验室啤酒发酵一、实验目的：熟悉静止培养操作，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。二、实验原理：啤酒酵母将麦芽汁发酵，产生酒精等发酵产物（啤酒）。三、实验器材：⑴.100升发酵罐。⑵.0~10OBX糖度表。(3).10℃-30℃可调生化培养箱。培养基：⑴.麦芽汁发酵培养基10Plato,50升，糖化制取。⑵.麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁加2％琼脂，自然pH。⑶.麦芽汁液体培养基：酵母扩大培养用。菌种：啤酒生产用酵母菌株。四、实验步骤：（1）麦汁制备（2）酵母菌种分离纯化与质量鉴定（3）菌种扩大培养（4）啤酒主发酵：麦汁50升，10OBX，11℃→接种量×107个细胞/mL→主发酵，11℃，5~7天→至时结束（嫩啤酒）。在主发酵过程中，每天测定下列项目：糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、α-氨基氮、还原糖、酒精度、pH、双乙酰。然后以时间为横坐标，这些指标为纵坐标，叠画于方格纸上。（5）后发酵五、作业要求（1）.画出发酵周期中上述上述指标的曲线图，并解释它们的变化。（2）.记下操作体会与注意点。实验一协定法糖化试验一、实验目的：协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会（EBC）推荐的评价麦芽质量的标准方法，我们用该法进行小量麦芽汁制备，并借此评价所用麦芽的质量。二、实验原理：利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸（具体参见理论部分第二节）。三、实验器材和试剂：1实验室糖化器：由水浴和500~600mL的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻棒搅拌或用100℃温度计作搅拌器（此时搅拌应十分小心，以免敲碎水银头）。实验时杯内液面应始终低于水浴液面。最好采用专用糖化器：该仪器有一水浴，水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置。水浴上有4~8个孔，每个孔内可放一糖化杯，糖化杯由紫铜或不锈钢制成，每一杯内都带有搅拌器，转速为80~100转/分，搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同，但又不碰杯壁，它离杯底距离只有1~2mm。2白色滴板或瓷板，玻棒或温度计。3滤纸，漏斗，电炉。4碘溶液，：克碘和5克碘化钾溶于水中，稀释到1000毫升。四、实验步骤1.协定法糖化麦汁的制备（1）取50g麦芽，用植物粉碎机将其粉碎。（2）在已知重量的糖化杯（500~600mL烧杯或专用金属杯）中，放入50g麦芽粉，加200mL46~47℃的水，于不断搅拌下在45℃水浴中保温30分钟。（3）使醪液以每分钟升温1℃的速度，升温加热水浴，在25分钟内升至70℃。此时于杯内加入100mL70℃的水。（4）70℃保温1小时后，在10~15分钟内急速冷却到室温。（5）冲洗搅拌器。擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g。（6）用玻棒搅动糖化醪，并注于干漏斗中进行过滤，漏斗内装有直径20厘米的折叠滤纸，滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿。（7）收集约100mL滤液后，将滤液返回重滤。过30分钟后，为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层。将整个滤液收集于一干烧杯中。在进行各项试验前，需将滤液搅匀。2.糖化时间的测定⑴在协定法糖化过程中，糖化醪温度达70℃时记录时间，5分钟后用玻棒或温度计取麦芽汁1滴，置于白滴板（或瓷板）上，再加碘液1滴，混合，观察颜色变化。⑵每隔5分钟重复上述操作，直至碘液呈黄色（不变色）为止，记录此时间。由糖化醪温度达到70℃开始至糖化完全无淀粉反应时止，所需时间为糖化时间。报告以每5分钟计算：如10分钟10~15分钟15~20分钟等正常范围值浅色麦芽：15分钟内深色麦芽：35分钟内3.过滤速度的测定以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算，以快、正常和慢等来表示，1小时内完成过滤的规定为“正常”，过滤时间超过1小时的报告为“慢”。4.气味的检查糖化过程中注意糖化醪的气味。具有相应麦芽类型的气味规定为“正常’,因此对深色麦芽若有芳香味，应报以“正常”；若样品缺乏此味，则以“不正常”表示，其它异味亦应注明。5.透明度的检查麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示。6.蛋白质凝固情况检查强烈煮沸麦芽汁5分钟，观察蛋白质凝固情况。在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀，记录为“好”；若蛋白质凝结细粒状，但麦汁仍透明清亮，则记录为“细小”；若虽有沉淀形成，但麦芽汁不清，可表示为“不完全”；若没有蛋白质凝固，则记录为“无”。五、注意事项：粉碎最好用EBC粉碎机，若用1号筛粉碎，细粉约占90%，用2号筛粉碎细粉约占25%。对溶解度好的麦芽，建议用2号筛。因为细粉太多影响过滤速度。一般要求粗粒与细粒(包括细粉)的比例达1：以上。麦皮在麦汁过滤时形成自然过滤层，因而要求破而不碎。如果麦皮粉碎过细，不但会造成麦汁过滤困难，而且麦皮中的多酚、色素等溶出量增加，会影响啤酒的色泽和口味。但麦皮粉碎过粗，难以形成致密的过滤层，会影响麦汁浊度和得率。麦芽胚乳是浸出物的主要部分，应粉碎得细些。为了使麦皮破而不碎，最好稍加回潮后进行粉碎。六、思考题：糖化过程中麦芽中各种酶的作用。实验二啤酒酵母的扩大培养一、实验目的：学习酵母菌种的扩大培养方法，为实验室啤酒发酵准备菌种。二、实验原理：在进行啤酒发酵之前，必须准备好足够量的发酵菌种。在啤酒发酵中，接种量一般应为麦芽汁量的10%（使发酵液中的酵母量达1×107个酵母/mL），因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行酵母菌种的扩大培养。扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母，另一方面是使酵母由最适生长温度（28℃）逐步适应为发酵温度（10℃）。三、实验器材：恒温培养箱，生化培养箱，显微镜等。四、实验步骤：本次实验拟用60升麦芽汁，因此应制备6000mL含1×108个酵母/mL的菌种，以每班10个组计算，每个组应制备约600mL菌种。建议流程如下：28℃，2天菌种扩大:麦汁斜面菌种→麦汁平板——→镜检，挑单菌落3个，接种50mL麦汁试管（或三角瓶）—20℃，2天→550mL麦汁三角瓶—15℃，2天→计数备用。每天摇动3次每天摇动3次1培养基的制备取协定法制备的麦芽汁滤液（约400mL），加水定容至约600mL，取50mL装入250mL三角瓶中，另550mL至1000mL三角瓶中，包上瓶口布后，Mpa灭菌30分钟。2菌种扩大培养按上面流程进行菌种的扩大培养（斜面活化菌种由教师提供）。注意无菌操作。五、注意事项：灭菌后的培养基会有不少沉淀，这不影响酵母菌的繁殖。若要减少沉淀，可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。六、思考题：菌种扩大过程中为什么要慢慢扩大，培养温度为什么要逐级下降。实验三麦芽汁的制备一、实验目的：熟悉麦芽汁的制备流程，为啤酒发酵准备原料。二、实验原理：麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。由于麦芽的价格相对较高，再加上发酵过程中需要较多的糖，因此目前大多数工厂都用大米做辅料。三、实验器材：在糖化车间一般有四种设备：糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅，本实验由于受条件限制，只能采用单式设备，即将糊化锅、糖化锅和麦汁煮沸锅合而为一。四、实验步骤：1.糖化用水量的计算糖化用水量一般按下式计算：W=A（100—B）/B式中B为过滤开始时的麦汁浓度（第一麦汁浓度）A为100Kg原料中含有的可溶性物质（浸出物重量百分比）W为100Kg原料（麦芽粉）所需的糖化用水量（升）。例：我们要制备60升10度的麦芽汁，如果麦芽的浸出物为75%，请问需要加入多少麦芽粉？因为W=75（100—10）/10=675升即100Kg原料需675升水，则要制备60升麦芽汁，大约需要添加10Kg的麦芽和60升左右的水（不计麦芽溶出后增加的体积）。2.糖化糖化是利用麦芽中所含的酶，将麦芽和辅助原料中的不溶性高分子物质，逐步分解为可溶性低分子物质的过程。制成的浸出物溶液就是麦芽汁。传统的糖化方法主要有两大类，（1）煮出糖化法：利用酶的生化作用及热的物理作用进行糖化的一种方法。（2）浸出糖化法：纯粹利用酶的生化作用进行糖化的方法。本实验采用浸出糖化法。推荐使用如下流程：35~37℃，保温30分钟--→50~52℃60分钟--→65℃30分钟（至碘液反应基本完全）--→76~78℃送入过滤槽。3.麦汁过滤将糖化醪中的浸出物与不溶性麦糟分开，以得到澄清麦汁的过程。由于过滤槽底部是筛板，要借助麦糟形成的过滤层来达到过滤的目的，因此前30分钟的滤出物应返回重滤。头号麦汁滤完后，应用适量热水洗糟，得到洗涤麦汁。4.麦汁煮沸将过滤后的麦汁加热煮沸以稳定麦汁成分的过程。此过程中可加入酒花（一种含苦味和香味的蛇麻之花，每100升麦汁中添加约200克）。煮沸的具体目的主要有：破坏酶的活性；使蛋白质沉淀；浓缩麦汁；浸出酒花成分；降低pH；蒸出恶味成分；杀死杂菌；形成一些还原物质。添加酒花的目的主要有：赋予啤酒特有的香味和爽快的苦味；增加啤酒的防腐能力；提高啤酒的非生物稳定性。将过滤的麦汁通蒸汽加热至沸腾，煮沸时间一般控制在~2小时，蒸发量达15~20%（蒸发时尽量开口，煮沸结束时，为了防止空气中的杂菌进入，最好密闭）。0.回旋沉淀及麦汁预冷却：将煮沸后的麦汁从切线方向泵入回旋沉淀槽，使麦汁沿槽壁回旋而下，借以增大蒸发表面积，使麦汁快速冷却，同时由于离心力的作用，使麦汁中的絮凝物快速沉淀的过程。1.麦汁冷却将回旋沉淀后的预冷却麦汁通过薄板冷却器与冰水进行热交换，从而使麦汁冷却到发酵温度的过程。7.设备清洗由于麦芽汁营养丰富，各项设备及管阀件（包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器）使用完毕后，应及时用洗涤液和清水清洗，并蒸汽杀菌。五、注意事项：1.若加热、煮沸过程中将蒸汽直接通入麦汁中，则由于蒸汽的冷凝。麦汁量会增加，因此最好用夹套加热的方法。2.麦汁煮沸后的各步操作应尽可能无菌，特别是各管道及薄板冷却器应先进行杀菌处理。六、思考题：麦芽粉碎程度会对过滤产生怎样的影响？实验四啤酒主发酵一、实验目的：学习啤酒主发酵的过程，掌握酵母发酵规律。二、实验原理：啤酒主发酵是静止培养的典型代表。是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中，在一定温度下培养的过程。由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物，先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长，然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。显然，同样体积的液体培养基用粗而短的容器盛放比细而长的容器氧更容易进入液体，因而前者降糖较快（所以测试啤酒生产用酵母菌株的性能时，所用液体培养基至少要米深，才接近生产实际）。定期摇动容器，既能增加溶氧，也能改善液体各成份的流动，最终加快菌体的生长过程。这种有酒精产生的静止培养比较容易进行，因为产生的酒精有抑制杂菌生长的能力，容许一定程度的粗放操作。由于培养基中糖的消耗，CO2与酒精的产生，比重不断下降，可用糖度表监视。若需分析其他指标，应从取样口取样测定。三、实验器材：带冷却装置的发酵罐（50L，100L），若无发酵装置，可将玻璃缸放于生化培养箱中进行微型静止发酵。四、实验步骤：将糖化后冷却至10℃左右的麦芽汁送入发酵罐，接入酵母菌种（实验四，共约5升），然后充氧，以利酵母菌生长，同时使酵母在麦汁中分散均匀（充氧，即通入无菌空气，也可在麦汁冷却后进行，一般温度越低，氧在麦汁中的溶解度越大），待麦汁中的溶解氧饱和后，让酵母进入繁殖期，约20小时后，溶解氧被消耗，逐渐进入主发酵。由于发酵罐密闭，很难看清发酵的整个过程，建议一个组在1000mL玻璃缸中进行啤酒主发酵小型试验。具体方法如下：1、洗标本缸，缸口用8层纱布包扎后，进行高压灭菌；2、将协定法糖化得到的麦汁，加水至600mL，再加葡萄糖使糖度达到10Bx，灭菌，冷却后摇动充氧，沉淀，将上清液以无菌操作方式到入已灭菌的标本缸中。3、将50mL酵母菌种接入，在10℃生化培养箱中发酵，每天观察发酵情况。4、主发酵：10℃，7天→至plato时结束（嫩啤酒）。一般主发酵整个过程分为酵母繁殖期，起泡期、高泡期、落泡期和泡盖形成期等五个时期。仔细观察各时期的区别。主发酵测定项目接种后取样作第一次测定，以后每过12或24h测1次直至结束。全部数据叠画在1张方格纸上，纵坐标为7个指标，横坐标为时间。共测定下列几个项目：a、糖度（用糖度表测，并换算成p