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1本科学生实验报告学号104120440姓名孙永升学院生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称发酵工程学实验教师及职称唐湘华讲师开课学期2012至2013学年第二学期填报时间2013年5月15日云南师范大学教务处编印2实验名称实验方式小组成员实验六细菌液体发酵生产淀粉酶小组合作XXXXXXXX一、实验原理及内容1、实验目的1.1了解产淀粉酶的微生物；1.2了解液体发酵操作过程；1.3了解发酵罐的结构构成；2、实验设备及材料2.1发酵培养基蛋白胨2％,酵母膏1％,木薯淀粉2％,氯化钠0.2%。pH6.0，121℃，灭菌30min。2.2菌种：T4细菌2.3器材：三角瓶、烧杯、天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱，发酵罐，摇床等。3、实验原理及实验流程或装置示意图：3.1实验原理：将产淀粉酶的枯草芽孢杆菌T4细菌接种于富含淀粉的培养基中诱导发酵产生淀粉酶。微生物生产的a-淀粉酶可以说是一种半合成酶大多数工业生产的淀粉酶菌种，如；枯草杆菌、米曲霉、淀粉液化芽孢杆菌等，即使培养基种不含淀粉或者不含有具有a-1、4键的多糖或低聚糖，仍然可以生产a-淀粉酶，但是它们的产量可受到淀粉或其它a-1，4麦芽寡糖的诱导而增加。氮源：是合成a-淀粉酶的原料①有机氮：各种氨基酸与酪蛋白的酶水解物有利于a-淀粉酶的生成。实际生产中，酪蛋白、豆饼的热、碱水抽出物是工业上最优良的氮源。②无机氮：硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵及尿素等无机氮均可在不同程度上增加a-淀粉酶的产量，但大多喜用硝酸钠。整个实验按照“菌种的培养、空消、实消、接种、发酵、放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成3和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。3.2装置示意图:图一200L发酵罐与种子罐。发酵罐图一3.3操作流程工艺图：整个实验按照“菌种的培养、空消、实消、接种、发酵、放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。44.操作步骤、注意事项：4.1操作步骤1、装料，开动搅拌，定容后，加入食用油10毫升用于消泡；2、排空夹套水，通入蒸汽对物料加热，三路进汽；物料温度升到80℃，停止搅拌。3、排空冷空气，升压到0.1MPa,保压30min；4、夹套降温，物料温度降到80℃，启动搅拌，注意罐压，当罐压降到0.05MPa时，通入空气，保持罐压在0.07Mpa；5、温度降低到37℃就可以接种，接种方式采用火焰烧；6、根据通风比和控制参数要求进行罐压、搅拌的调整。4.2方法与注意事项（一）原则1．通蒸汽前先关闭所有阀门2．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。3．活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。7．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。58．蒸汽对设备与物料灭菌中注意安全，控制时间、压力限制。9．操作中注意发酵参数监测与控制。（二）空消：先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。4．罐压升至所需温度（121℃）时开始计时，保温保压30min。保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。近罐空气阀的尾阀要一直微开启。注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。（三）种子制备：液体摇瓶培养。（四）培养基配制、实消：关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、保温30分钟→实消结束。（五）冷却接种与发酵：1、待培养基冷却至28℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。2、将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。6（六）参数监测每隔6h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。Ⅰ.pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。Ⅱ.生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000rpm,3～5min)离心，收集上清液，用小离心机（10000rpm，1min）用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2h左右），然后测其干重，取平均值。Ⅲ.酶活：DNS法测定淀粉酶活（七）后续工作：罐体清洗，药品整理归类，物品放好。二、实验结果及分析1.1枯草芽孢杆菌T4发酵过程形态观察：发酵液浑浊黄色，恶臭味。对发酵液用番红染色观察呈杆状，无杂菌污染。如图二图二发酵液番红染色结果1.2淀粉酶活测定：酶活力单位（U/ml）={[K(ODA+ODB)]/2+b}×N×103/10/0.2/180.2式中：ODA——A管的吸收光度值；103——mg转换为ug；ODB——B管的吸收光度值；180.2——葡萄糖的摩尔质量；N——酶液的稀释倍数；10——表示酶反应时间为10min；K：标准曲线斜率。7回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023。酶活力单位（U/ml）={[K(ODA+ODB)]/2+b}×N×103/10/0.2/180.2=0.794U/ml结果与讨论：对发酵液跟踪监测（菌染：形态观察）无污染，基本为枯草芽孢杆菌T4。因为测定时未完全真确按六小时测定一次，酶活测定发现测定结果较低。按照发酵时间总体上是呈上升趋势，测定过程中只对发酵液：液体、菌体简单离心操作，未作发酵液提纯压缩处理，等于酶液稀释较低水平，因此结果低。三、实验小结通过亲自体验本次试验，能够真正了解到微生物发酵的过程，将课本上的东西都结合到实验来，并且对一些不理解的器具也有了充分的认识，包括对发酵罐各个部件的，各个管路的认识以及他们的作用。在操作过程中我们要严格自己的操作,实验测量的数据要保持真实性。最重要的是掌握一般发酵罐的常规操作、流程。可以更好地为实习打下基础，提高操作技能水平。参考文献[1]金明晓,赵丹丹.根霉液体发酵产淀粉酶条件优化的研究[J].吉林工程技术师范学院学报,2003,12(19):52~54.[2]罗军侠,李江华,陆健,房俊.耐酸生淀粉糖化酶的菌种筛选、酶的性质及发酵条件[J].食品工业科技,2008(05):151~154.8指导老师评语及得分：签名：2013年05月日