高效液相色谱法

高效液相色谱讲议高效液相色谱仪(HPLC)目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。美国Agilent美国Waters美国戴安日本岛津美国VARIAN日本岛津液相色谱理论发展简况色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱分离过程Temporalcourse流动相液相色谱理论发展简况液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。液相色谱理论发展简况它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。开机前的准备工作1、将试验中要求的流动相配制好。2、流动相要抽滤除气。3、安装好试验要求的色谱柱。正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。色谱柱常用的pH值:随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。反相HPLC极性:固定相流动相固定相-极性弱流动相(甲醇,乙腈等)-极性强极性大物质先出峰正相HPLC极性:固定相流动相固定相-极性强流动相(己烷,庚烷)-极性弱极性小物质先出峰主流固定相与流动相物理性质•硅胶纯度•色谱柱尺寸•颗粒形状•粒径•表面积•孔径•键合类型•碳覆盖率•封端化学性质固定相-填充材料物理性质•硅胶纯度•色谱柱尺寸•颗粒形状•粒径•表面积•孔径填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度固定相-填充材料•键合类型•碳覆盖率•封端化学性质固定相-填充材料开机顺序：1、打开主机，检测器，色谱工作站等电源开关。2、将配制好的流动相放入流动相通道内，旋开排液（或灌注）旋钮，将流动相管路中残存的老溶剂用流动相替换掉。3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流速升高。平衡至少30分钟后准备进样。进样前准备——样品过滤一次性注射器针式（头）过滤器样品瓶仪器：手动进样器-六通阀/定量环手动进样器工作原理装填状态样品注入手动进样器仪器：检测器UV/Vis双灯，全波长检测ＤＡＤ检测器流路仪器：检测器-紫外荧光检测器蒸发光检测器质谱检测器基本概念和术语色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。基线(baseline)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移基本概念和术语色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。峰底—基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peakheight，h)—峰的最高点至峰底的距离。基本概念和术语峰宽（peakwidth，W)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)—峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ峰面积(peakarea，A)—峰与峰底所包围的面积。保留时间(retentiontime，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。基本概念和术语理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。理论塔板数(N)分离度(R)基本概念和术语拖尾因子(tailingfactor，T)——T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。关机顺序：1、试验所用的流动相中如含有缓冲盐，应先将流速停下来，将流动相替换成水。2、旋开排液（或灌注）旋钮，将流动相管路中残存的流动相用水替换掉。3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流速升高。至少冲洗30分钟后，将流速停下来。将流动相管路中的水替换成甲醇-水（50：50）。4、旋开排液（或灌注）旋钮，将流动相管路中残存的水用甲醇-水（50：50）替换掉。5、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流速升高。至少冲洗20分钟后，将流速停下来。反相色谱柱不用时应用甲醇饱和存放。关掉电源HPLC法定性或定量HPLC法定性常用于鉴别项。通过与对照品保留时间的一致性来进行定性。液相色谱分离定量常用的基本公式a:外标法含量（CX）=CR×AX/ARCX为供试品浓度AX为供试品峰面积CR为对照品浓度AR为对照品峰面积液相色谱分离定量常用的基本公式b:内标法校正因子（f）=AS×CR/CS×AR含量（CX）=f×AX×CS/ASAX为供试品峰面积CX为供试品浓度AR为对照品峰面积CR为对照品浓度AS为内标峰面积CS为内标浓度报告书书写内容：检品名称：******片批号：200702016检验项目：中国药典2005年版二部附录ⅤD标准规定：含******应为标示量的90.0%～110.0%仪器编号：YQ.H.测定日期：室温：℃色谱柱编号：色谱柱规格：4.6mm×250mm色谱柱：固定相C18柱温：25℃检测器：紫外检测器检测波长：260nm流动相：水—乙腈（60∶40）流速：1ml/min进样量：20μl报告书书写内容：理论板数规定值：按******峰计算不低于1000测定值：分离度规定值：大于1.5测定值：对照品名称：******对照品批号：123-200701对照品来源：中国药品生物制品检定所报告书书写内容：试验方法试验计算试验结果试验结论HPLC日常维护－总结一、定期检查溶剂过滤器查看过滤器是否变色．－临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常．清洁溶剂过滤器－将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂然后将过滤器放在装有浓硝酸（35％）的烧杯里浸一小时，不要使用超声波清洗。－用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器。建议不使用超声波清洗机清洗。－将过滤器重新装好。－建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。注意：不要使用没有安装溶剂过滤器的系统．可能会严重堵塞系统日常维护流动相应经过0.45um或更小孔径的滤器过滤，如果使用滤膜，注意有机膜与水膜的区别(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂)注意不同检测器流通池耐压问题，尽量避免使用pH9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞。使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个需要考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。如何预防液相泵的故障:要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:1)、用高质量试剂和HPLC级溶剂；2）、过滤流动相和溶剂；3）、脱气；4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法基线噪音大可能由那些原因引起可能原因是：泵压不稳，流动池有气泡，流动池被污染，对紫外检测器可将流动池移走即可确认。色谱柱污染，系统管路污染。灯能量不足，光学系统老化或污染，参数设不合理。外界因素影响，如电源，温度和湿度，震动，等。峰面积重现性不好1.首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。2.若压力稳定但峰面积呈无规律变化，请检查样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。3.若压力稳定且峰面积呈规律变化，多数为色谱柱未平衡好。保留时间不稳定1.首先观察保留时间是否有规律的变化，并同时观察压力是否稳定，若压力稳定而保留时间呈有规律变化，多数是色谱柱未平衡好，特别是含有的流动相，需较长的时间去平衡。2.若压力稳定而保留时间无规律变化，请检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间，如仍然不佳，可更换一色谱柱。3.若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，