过表达慢病毒载体构建和包装手册version1

1/33过表达慢病毒载体构建和包装手册Version1.0吉凯基因二零一一年五月2/33目录简介……………………………………………………………………3第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程……………………………………………………………4实验材料…………………………………………………………5过表达克隆制备……………………………………………………6第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程……………………………………………………………17实验材料……………………………………………………………18Lentivirus病毒包装………………………………………………21病毒的收获及浓缩…………………………………………………22Lentivirus滴度测定………………………………………………24参考文献………………………………………………………………333/33简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE(woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。4/33第一部分过表达慢病毒载体的制备一、流程图从含有目的基因的质粒中，利用PCR方法钓取目的基因，将目的载体进行酶切，酶切产物电泳回收后进行交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。5/33二、实验材料描述a)主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.1kpDNAladderMarkerFermentas公司#SM0311250bpDNAladderMarker捷瑞公司DL250+,100T琼脂糖赛百盛公司GA4-100限制性内切酶NEB公司R0136VIn-Fusion™PCRCloningKitclontech639626TaqpolymeraseSinoBioE001-02BdNTPTakaraD4030APrimer捷瑞生物Plasmid抽提KitPromegaA1460b)主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.PCR仪AppliedBiosystems公司2720thermalcyclerpositiveclone测序美季生物技术ABI3730型稳压DNA电泳仪BioRad公司凝胶成像仪天能公司细菌摇床华利达实验设备公司HI-9211K细菌培养箱上海一恒科学仪器有限公司Gilson移液器吉尔森公司高速离心机日立公司TGL-16G-A6/33三、过表达克隆制备——以STK39基因为例描述详细实验过程1.基因信息：Symbol：STK39Accession：NM_013233Organism：HumanDescription：Homosapiensserinethreoninekinase39(STK39),mRNA.2.工具载体:载体图谱载体说明载体编号：GV208元件顺序：Ubi-MCS-EGFP荧光标记：EGFP真核抗性：克隆位点：AgeI3.载体酶切：酶切反应温度：37℃酶切反应时间：2h酶切反应体系：试剂体积ddH2O42µL10×buffer15µL7/33纯化的DNA质粒（1ug/µL）2µLAgeI（5U/µL）1µLTotal50µL1.1.1载体酶切结果：载体酶切电泳图谱电泳图说明1#:Marker(条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)2#:GV208Vector3#:AgeIdigestedGV208Vector1.2目的基因片段的获取1.2.1引物IDseqStk39-AgeI-FGAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCGGAGCCGAGCGGCStk39-AgeI-RTCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC引物说明：含交换配对碱基、酶切位点（下划线标记的），表达增强序列（双下划线记的）以及目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因1.2.2PCR扩增目的基因片段PCR反应体系：8/33试剂体积（µL）ddH2O12.45×Taqbuffer4dNTPs(2.5mM)1.6Primer（+）（10µM）0.4Primer（-）（10µM）0.4Template（10ng/µL）1Taqpolymerase0.2PCR反应条件：94℃5min94℃30sec55℃30sec72℃2min72℃10min4℃∞1.2.3PCR结果PCR产物电泳图电泳图说明121#：PCR产物2#：Marker从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp30cycle9/331.3重组质粒构建模式图1.3.1PCR产物交换入线性化表达载体反应条件：25℃30分钟→42℃15分钟反应体系：反应体系(µL):阳性对照自连对照实验组ddH2O17.5-X-Y17.5-X17.5-X-Y10×In-Fusion交换酶缓冲液222In-Fusion交换酶0.50.50.5线性化载体DNAXXX纯化后PCR产物片段Y0Y10/33说明：a)加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为：1：3~1：9之间b)阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因（同样带有交换臂）1.3.2制备感受态细胞：配置下述溶液：1)0.1MCaCl2溶液，以0.22µm过滤除菌。2)250mMKCl2溶液。3)2MMgCl2溶液，高压灭菌。4)SOB:1ml250mMKCl2溶液加入100mlLB，以5MNaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml2MMgCl2溶液。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞1)从于37oC培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中。于37oC剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转／分)。2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0oC。3)于4oC,以4000转／分离心10分钟，回收细胞。4)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。5)以10ml用冰预冷的0.1mol／LCaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。6)于4oC，以4000转／分离心10分钟，回收细胞。Total20202011/337)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀。9)将细胞分装成小份，放于-70oC冻存。（感受态细胞制备参考：分子克隆实验指南第二版55页）1.3.3转化：1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200µL转移到无菌的微量离心管中，每管加10µL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l—2分钟。4)每管加800µLLB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。5)将150µL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性（100ug/ml）的LB琼脂培养基上。6)将平板置于室温直至液体被吸收。7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。8)长出的克隆进行后续PCR鉴定。（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）1.4阳性克隆的PCR鉴定1.4.1引物IDseqStk39-SEQFCGGTGAATGCTGGTGGCATCEGFP-N-RTCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC12/33引物说明：本对引物一个位于目的基因中，一个位于载体上，用于菌落PCR鉴定转化子1.4.2PCR鉴定PCR反应体系：试剂体积（µL）ddH2O12.45×Taqbuffer4dNTPs(2.5mM)1.6Primer（+）（10µM）0.4Primer（-）（10µM）0.4Template1Taqpolymerase0.2PCR反应条件：94℃3min94℃30sec60℃30sec72℃30sec72℃5min4℃∞1.4.3PCR结果PCR产物电泳图30cycle13/3312345678样品说明：泳道样品编号1#阴性对照（ddH2O）2#阴性对照（空载自连对照组）3#阳性对照（GAPDH）4#Marker：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp5#～8＃Stk39-1～4号转化子接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200µL送测序1.5阳性克隆测序结果及结果分析：ref|NM_016866.2|Musmusculusserine/threoninekinase39,STE20/SPS1homolog(yeast)(Stk39),mRNAgb|BC064443.1|Musmusculusserine/threoninekinase39,STE20/SPS1homolog(yeast),mRNA(cDNAcloneMGC:69607IMAGE:6843981),completecdsLength=326814/33GENEID:53416Stk39|serine/threoninekinase39,STE20/SPS1homolog(yeast)[Musmusculus](Over10PubMedlinks)Score=3083bits(1669),Expect=0.0Identities=1669/1669(100%),Gaps=0/1669(0%)Strand=Plus/PlusQuery84CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCAggcggccccggt143||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct104CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCAGGCGGCCCCGGT163Query144gacagcggcggcggcgacggccccggcggccgcgacatcagcaccag