植物病害研究

植物病害研究法实验实验一：培养基的制作与灭菌一、配方：马铃薯去皮200g，蔗糖20g，自来水1000ml，琼脂18g，自然pH二、步骤：1.称取去皮新鲜马铃薯200g切成指甲盖大小的方块，放于小铝锅中，加入1000ml自来水，放在电炉上煮。煮到用玻璃棒稍微按一下即烂即可2.用四层纱布过滤3.将事先准备好的琼脂剪碎，然后和过滤后的溶液一起放入锅中加热煮至琼脂全部溶（用玻璃棒挑看上面有无琼脂条即可）4.将溶化后的琼脂一起倒入事先放入蔗糖的1000ml烧杯5.将熬制好的培养基倒入三角瓶中，倒入三角瓶的量不要太满，以免以后用时加热时发生事故6.用棉塞塞住，再用报纸包好后，用绳子勒紧即可7.放入灭菌锅中灭菌三、注意事项：1.制备培养基的用具不宜用铁锅或铜锅。因为培养基中含铜量超过0.3mg/L或含铁量超过0.4mg/L时就可能影响微生物的正常生长发育2.实验做完后，关电，检查储水池是否被杂物塞住3.做好卫生以及整理好实验材料NA培养基：一、配方：牛肉膏3g,蛋白胨10g，琼脂15~20g，葡萄糖5~10g，自来水1000mlpH7.0~7.2二、步骤：1.用玻璃棒挑取牛肉膏3g，蛋白胨10g，放入小烧杯式表面皿中，把称量好的配方加水置电磁炉中搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解2.向小铝锅中量取500ml的自来水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨洗入铝锅中并用自来水冲洗2~3次，在电磁炉上边加热边搅拌3.加入称量好的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，再加入称量好的葡萄糖，搅拌均匀后，补足水量至1000ml4.分别装于250ml的锥形瓶中，塞好棉塞，捆扎好5.高压蒸汽灭菌121℃,灭菌实验二：病原物人工接种一、实验原理：从病植物上分离到的微生物不一定具有致病性的病原物只用通过接种植物体才能确定他的致病性。对于病原菌致病性的测定，不仅是病原物鉴定时不可缺少的工作，在病原菌致病性研究和作物不同品种抗病性的研究中都必须通过接种来测定他们的差异。因此，接种技术是植病研究工作中的一项基本技能。也是柯赫氏法则中最重要的一步。柯赫氏法则有三条：①这种微生物经常于某种病害有联系，发生这种病害往往就有这种微生物的存在②从病组织上可以分离到这种微生物的纯培养，并且可以在各种培养基上研究它的性质③将培养的菌种接种到健康植株上，可诱发与原来相同的病害④从接种后发病的植物上在分离到原来的微生物二、实验步骤：1.白菜软腐病菌的接种：①取无病的白菜帮两片，用脱脂棉沾取75%的乙醇表面消毒，自然干燥后备用②用无菌针分别在两片白菜帮上刺出梅花状小孔，孔与孔之间大于1cm③挑取白菜帮软腐病菌涂抹于一片菜帮的伤口处，一片不接种，设为对照④脱脂棉蘸取无菌水放于伤口处⑤写好标签，28℃保湿箱中培养，3天后观察发病情况2.涂抹法接种锈菌：①选取杂草锈菌，把锈孢子收集起来放在白纸上备用②选取幼嫩杂草，用手指轻轻摩擦叶表面，擦出微伤口，用手指蘸水在草叶上画出一道水膜，把收集到的孢子涂抹在叶片上③用塑料袋套住已接种的在草叶上，保湿24h后观察所接种草叶的发病情况。未发病的原因：锈孢子致病力不强，环境条件不适宜，杂草抗病能力强实验三：单孢分离技术一、实验原理：单孢分离的方法很多，例如振落法，稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法使用真菌孢子经稀疏地分散在水琼脂平板上，然后再显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，找到单个孢子标记好后移植到PDA斜面培养基上，置室温下培养，形成的菌落即为单孢细菌，直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法二、实验步骤：1.利用震落法进行单孢分离：①用无菌操作将熔化冷却60~70℃水琼脂培养基约10ml倒皿，凝固成平板备用②按无菌操作要领，将盛水琼脂培养基打开30~45°，将长有较多孢子材料（事先干燥好，易震落）伸进水琼脂平板，轻轻震动，使孢子稀疏落在平板表面，震落时宁轻勿重，防止过多孢子落在水琼脂表面③水琼脂平板翻转置显微镜载物台上，用低倍（10*10）找单个孢子，标记④将标记好的单孢移植到PDA上，标注，25℃⑤数月后，如在培养基上生出菌丝并形成孢子，镜检是否是纯菌体2.利用稀释法进行单孢分离①用灭菌水配制成孢子悬浮液，稀释到一滴孢子悬浮液20-30个孢子左右，用无菌吸管取一滴孢子悬浮液入灭菌培养皿。②将已熔化好并冷却45~50℃水琼脂培养基约10ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀，凝成平板。将上述孢子分散在平板上③与震落相同：将盛水琼脂培养基打开30~45°，将长有较多孢子材料（事先干燥好，易震落）伸进水琼脂平板，轻轻震动，使孢子稀疏落在平板表面，震落时宁轻勿重，防止过多孢子落在水琼脂表面实验四：病原真菌孢子的萌发一、实验原理：真菌孢子的萌发受内在因子和环境条件的影响。内在因子主要是孢子的成熟度寿命长短、休眠期限和生机的强弱等。环境因子主要有温湿度、氧气、营养条件等二、实验步骤：1.培养皿中萌发法：将10ml无菌水倒入长满病菌菌体的培养皿中，用L玻棒轻轻刮培养皿于烧杯中，使病菌菌体充分混合在无菌水中制成菌悬液。用双层纱布过滤菌悬液得到孢悬液，取适量孢悬液移入另一培养皿中，再加入适量无菌水，使其浸没皿底，然后放在28℃条件下培养24h后观察萌发情况，用血球计数板统计萌发率2.水琼脂表面萌发法:①取水琼脂加热解冻②倒水琼脂平板，冷却，凝固③制作病原真菌的孢悬液，移取1-2ml置于琼脂平板上，（两个重复）置于黑暗、光照24h（20℃）实验五：植物病原菌的拮抗作用测定实验操作：皿内拮抗性观察:3.在PDA平板上扩大繁殖靶标致病菌和生防菌4.在无菌条件下用无菌打孔器把病原菌和生防菌均打成多个菌饼备用5.将靶标致病菌均匀摆在PDA培养基上成等边三角形6.利用无菌操作技术分别将生防菌一块置于已经接种的靶标致病菌菌柄种羊，重复两次7.用不接生防菌一皿做对照8.标记25℃培养9.一周观察抑菌情况，记录抑菌圈大小，从而判断抑菌能力实验六：杀菌剂的室内生物测定实验操作：一、生长速率法：1.用消毒杯盛取配制好的不同浓度2.加热溶化PDA培养基，取49ml培养基加入1ml的药剂，充分摇匀后迅速倒入霉菌培养皿中，对照组培养皿加无菌水1ml3.无菌操作，用接种环移植一块纯培养菌种（菌落边缘取）移植平板中央，25℃培养48h测菌落直径二、抑菌圈法：1.在纯培养菌种试管中加入无菌水，配制孢子悬浮液2.溶化培养基，冷却加入0.2ml菌悬液，摇匀，倒平板3.取消毒杯，标记好菌落浓度，用镊子夹住滤纸片（消毒）放入各培养皿中（4-6片），标注4.处理好培养皿置于25℃培养箱，2-3天观察抑菌圈大小抑制百分率=（对照组菌落直径—处理组菌落直径）*100%/对照组菌落直径实验七：真菌的培养和生长力量的测定实验内容：1.培养基的观察①菌落的质地②菌落的形成是凸起的或又成型的菌丝体③形成成堆的孢子是干的或黏性的④各种子实体和休眠结构的形成和所需时间⑤菌落正面、背面颜色，有无色素参加培养基中⑥有无特殊气味⑦菌落有无部分呈扇形⑧成长率的快慢2.成长量测定方法①目力估测：观察琼脂斜面平板上菌丝体的多少②直线生长：将真菌移植在琼脂平板上培养，每隔一段时间，测菌落半径式直径③湿重测定：测定振荡式或通气搅拌培养的真菌④干重测定3.真菌的移植将长满菌的培养基在无菌条件下用灭菌的打孔器打成菌饼，然后用接种环、挑针等将其放入另外的培养基内培养实验八：病原菌的分离培养和纯化一、实验原理：植物病原菌的分离培养是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同而供给它们适宜的生活条件。即让病原菌生活在适宜的培养基上或加入某种抑制造成的只利于次菌生长，而抑制其它菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原菌的分离方法主要有组织分离和稀释分离法两种。最常用的方法就是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的方法。病原细菌的分离方法的划线分离法最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须进行分离菌的纯化。纯化的方法类似于分类工作中使用的稀释分离法或划线分离法二、实验操作：1.病原真菌分离（组织分离法）①取灭菌培养皿，标注②用无菌操作法向培养皿加25%乳酸1-2滴，防细菌污染，将冷却培养倒平板③取真菌叶斑病新鲜叶片，选典型病斑，用剪刀沿病健交界处取小块（2-4mm）。病组织块④取病组织放入70%酒精中3-5秒后，无菌操作移入0.1%升汞液中表面消毒0.5~3分钟，移灭菌水漂洗3次⑤无菌操作将病组织移植培养皿内，每皿内放4~6块⑥将培养皿倒置在25℃培养箱，3-4天观察结果⑦若病组织小块上长出均匀一致的菌落，则多半是要分离病原菌2.稀释分离法①取灭菌的培养皿三个，标注②用灭菌吸管吸取无菌水③用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中灭菌水混合④将熔化并冷却的培养皿分别放入三个培养皿中摇匀，凝固⑤将培养皿翻转置恒温箱25℃培养，观察菌落的生长情况实验九：叶面真菌粘贴检视及徒手切片检视实验操作：1.叶面真菌粘贴检视（透明胶带粘贴）为检查叶片表面真菌（白粉菌）和其他霉菌，取小段透明胶带，贴在真菌生长部位叶片上，真菌即粘在胶带上，取下胶带，放在载玻片上（加蒸馏水）检视2.徒手切片检视①材料选料大而坚硬的，夹在手指间切②一般材料徒手切片，将病组织沾湿，夹在表面很平的材料中间，随手慢慢向后退，用刀切成薄片，切下的薄片放在蒸馏水中，检查中显微镜下检视名词解释1.灭菌：指用物理或化学的方法，完全除去或杀死器物表面和内部的一切微生物。2.消毒：指消灭或减少病原微生物以防止侵染，而不是消灭所有微生物。3.发病率：指发病田块、植株、器官的发病百分率。4.严重度：指发病田块、植株、器官的损害程度。5.回归分析：若已知两个变量x和y之间有一定关系，一个变量y值在一定程度上随另一个变量x值变化而变化。前者称因变量，后者称自变量。6.平均数：7.变异系数：样本的(标准差)对均数的百分数。8.t分布：指当具有一个参数追求另一个参数的一组密度函数曲线。9.t测验：按t分布进行的假想实验。10.随机排列法：是将实验地根据重复数目分为若干大区，大区再根据不同处理分为若干小区，小区的各处理排列是随机的。11.相关系数：两个变量线性关系的密切地程度，如果用一个数量做指标，两者关系称相关系数。