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乙肝病毒的检测HBV的三种形态1,HepatitisBvirion(Daneparticle)2,secretedfilament3,secretedsphere6乙型肝炎病毒HBV•HBV是嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的哺乳动物属的一员。•HBV阳性的血清中有三种病毒颗粒．１.大球形颗粒，完整的HBV颗粒直径为42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原下面藏有e抗原。•２.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，为不完整的ＨＢＶ．•３.管形颗粒，实际上是一串小球形颗粒聚合在一起的，也含有表面抗原．5生物化学检测1HBV血清标志物的检测2HBV分子生物学诊断3HBV临床药物疗效检测4HBV感染的实验室检查1.乙型肝炎的生物化学检测•主要指标：–ALT,AST,ASTm，–血清白蛋白，–血清胆红素，–胆碱酯酶,–甲胎蛋白,–凝血酶原时间(PT)及部分凝血因子；6•方法学–ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；–胶体金免疫层析法(金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测；–化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；可间接反映宿主HBV的复制水平，在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。•新增检测指标–Pre–S1、Pre–S2及其相应抗体•对乙肝两对半认识72.HBV血清标志物检测8Pre–S1检测的临床价值前S1蛋白主要存在于Dane颗粒和管型颗粒上，在HBV感染宿主细胞过程及在病毒复制和刺激机体产生免疫反应中起重要作用;前S1抗原与HBeAg之间有高度相关性，并可区别因变异种及其他原因造成的乙肝病毒e抗原(HBeAg)假阴性，可作为HBeAg假阴性补充，从而准确反映患者体内病毒复制情况；可作为HBV感染及复制的标注，与其它血清标志物联合检测，相互补充。Back•乙型肝炎的两对半•1.乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和表面抗体(HBsAb)，2.e抗原(HBeAg)和e抗体(HBeAb)，3.核心抗原(HBcAg)和核心抗体(HBcAb)这三对乙肝病毒的抗原和抗体。•由于HBcAg主要存在于受感染的肝细胞及乙肝病毒颗粒的核心内，一般血清中较难检测到，只有用特殊的方法处理后才能查到，所以通常只能检测到HBcAb，也就是说这第三对通常只能检测到半对，所以称之为两对半。两对半是乙肝病毒最常用的血清学标记。乙肝五项的32种组合序号HbsAgHbsAbHbeAgHbeAbHBcAb1-----过去和现在未感染过HBV。1-30%2----+(1)既往感染未能测出抗-HBs；(2)恢复期HBsAg已消，抗-HBs尚未出现；(3)无症状HBsAg携带着。5-10%3---++(1)既往感染过HBV；(2)急性HBV感染恢复期；(3)少数标本仍有传染性。①HBV感染已过；②抗HBs出现前的窗口期2-10%4-+---(1)注射过乙肝苗有免疫；(2)既往感染；③假阳性1-6%5-+-++急性HBV感后康复。0.5-5%6+---+(1)急性HBV感染；(2)慢性HBsAg携带者；(3)传染性弱。10-15%7-+--+既往感染，仍有免疫力。HBV感染，恢复期。5-15%8+--++(1)急性HBV感染趋向恢复；(2)慢性HBsAg携带者；(3)传染性弱。即俗称的“小三阳”。5-10%9种常见模式9+-+-+急性或慢性乙型肝炎感染。提示HBV复制，传染强。即俗称的“大三阳”。30-40%10+----(1)急性HBV感染早期,急性HBV感染潜伏期；(2)慢性HBV携带者，传染性弱。11+--+-(1)慢性HBsAg携带者易转阴；(2)急性HBV感染趋向恢复。12+-+--急性HBV感染早期或慢性携带者，传染性强。13+-+++(1)急性HBV感染趋向恢复；(2)慢性携带者。14++---(1)亚临床型HBV感染早期；(2)不同亚型HBV二次感染。15++--+(1)亚临床型HBV感染早期；(2)不同亚型HBV二次感染。16++-+-亚临床型或非典型性感染。17++-++亚临床型或非典型性感染。18+++-+亚临床型或非典型性感染早期。HBsAg免疫复合物，新的不同亚型感染。19--+--(1)非典型性急性感染；(2)见于抗-HBc出现之前的感染早期，HBsAg滴度低而呈阴性，或呈假阳性。20--+-+非典型性急性感染。21--+++急性HBV感染中期。22-+-+-HBV感染后已恢复。23-++--非典型性或亚临床型HBV感染。24-++-+非典型性或亚临床型HBV感染。25---+-急性HBV感染趋向恢复。26+++++①一种亚型的HBsAg及异型的抗HBs（常见）；②血清从HBsAg转化为抗HBs的过程（少见）。27-+++-28-++++29--++-30+-++-31+++--32++++-13HBeAg阴性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率8%-10%；HBeAg阳性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率2%-5%对HBeAg阴性患者应该开展更积极的治疗大三阳小三阳14•HBVDNA定量检测–病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关；–主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。•HBV基因分型–基因分型的必要性；–基因分型的主要方法；•HBV耐药突变的检测3.HBV分子生物学诊断病毒基因突变疾病进展临床表现对干扰素应答耐药变异生化学改善HBeAg血清学转换HBVDNA清除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化(LC)肝细胞癌(HCC)15HBV基因型/基因亚型分型方法优缺点序列测定法最直接，最可信，是HBV基因分型的金标准，但繁琐费时而且价格昂贵，混合型检测能力差，不适于大样本检测。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)较测序法简便，适于大样本检测，但由于需要进行酶切，所以操作仍较为繁琐，成本较高，并存在酶切不彻底等问题。pre-S2单克隆抗体酶联免疫测定(mAbsEIA法)简单、快速，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高并不能有效鉴别有些混合型感染和HBsAg低表达及某些表位表达不充分的标本。分子探针杂交法简单、快速，对混合型检测非常敏感，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高而且灵敏度和特异度还有待提高。型特异性引物PCR法简单、快速，成本低，具有较高的灵敏度，适于流行病学研究和临床大样本检测。但特异度还有待提高。常用HBV基因分型方法比较16客观看待乙肝DNA1.乙肝病毒DNA定量往往被描述成为判断乙肝传染性大小、病情严重程度以及治疗效果的“金指标”，其实这些认识都是片面的。乙肝病毒DNA定量检测为了解乙肝病毒在体内的变化增添了新的手段，弥补了以往乙肝病毒“两对半”检测的不足，只要抽血化验检测乙肝病毒DNA呈阳性，无论其他乙肝病毒检测结果如何，都说明患者体内存在复制状态的乙肝病毒，血液具有一定传染性，这对于评估治疗效果和了解病情变化有一定帮助。但是目前乙肝病毒DNA检测尚处于研究阶段，并非完美无缺•乙肝病毒DNA定量不能说明病情轻重乙肝病毒DNA定量数值只能说明游离在血液中病毒的含量，病毒多少、含量高低与病情严重程度没有直接关系。乙肝病情严重程度必须通过检测肝功系列指标确定，这些指标包括：转氨酶、胆碱酯酶、胆红素、白蛋白、凝血酶原活动度、转肽酶、蛋白电泳等等，凝血酶原活动度、白蛋白、胆碱酯酶数值越低，说明病情越严重。病毒定量数值高低与病情无直接关系。相反，绝大多数无症状乙肝病毒携带者，尤其是少年儿童患者，乙肝病毒DNA检测都为阳性，乙肝病毒处于高复制状态，而他们的病情十分轻微，肝穿结果显示，他们的肝组织仅为轻度的非特异性炎症改变；而大多数肝硬化或肝癌患者的乙肝病毒DNA检测多为阴性，而病情却十分严重。乙肝病毒本身不引起肝细胞病变，感染的肝细胞仍然是长寿的，半衰期6～12个月或更长。乙肝病情轻重决于很多因素，例如患者的免疫状态、遗传因素、病毒的变异等，病毒数量多少不是病情演变的决定因素。4.HBV临床药物治疗监测•乙肝病毒的耐药性检测，是精准治疗乙肝的关键！！–目前由于治疗不够规范，造成我国目前超过95%的乙肝患者发生耐药、病毒变异、病毒耐药，变异检测势在必行！19乙肝五项检测的影响因素1.样本采集与处理的影响1.1标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。1.2塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。1.3标本凝固不全，正常血液采集后1/2~2h开始凝固，18~24h血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。•2、试剂的影响2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%—99.3%,78~89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。•3、操作技术的影响3.1加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。3.2温浴影响，96孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。3.3冼涤是ELISA操作的重要环节，手冼条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。3.4肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。•4、HooK效应影响•钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。•随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。•5、干扰物质的影响有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用56℃30分钟灭活补