用于检测人HLA-B5801基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法

(10)申请公布号(43)申请公布日(21)申请号201410747581.5(22)申请日2014.12.10C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)(71)申请人苏州旷远生物分子技术有限公司地址215500江苏省苏州市常熟市高新技术开发区金都路8号(72)发明人王进何晓辉赵小龙吴梦华唐明慧吴子侠(74)专利代理机构南京知识律师事务所32207代理人汪旭东(54)发明名称用于检测人HLA-B*5801基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法(57)摘要本发明提供用于人HLA-B*5801等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法，根据“等位基因特异PCR”原理，在实时荧光定量PCR技术平台上检测人白细胞抗原HLA-B*5801等位基因。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表3页附图1页(10)申请公布号CN104404159A(43)申请公布日2015.03.11CN104404159A1/1页21.一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据HLA-B*5801等位基因特异位点设计，序列如下所示：正向引物：HLA-B*5801F:5’-CACGGAACATGAAGGCCTCC-3’反向引物：HLA-B*5801R:5’-CGGAGGAGGCGCCCGTAG-3’荧光探针：TM-HLA-B*5801:5’荧光基团-CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT-3’淬灭基团。2.一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的内控引物对及相应荧光探针，其特征在于所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：内控引物对：正向引物：GAPDHF:5’-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3’反向引物：GAPDHR:5’-TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3’内控荧光探针：荧光探针:TM-GAPDH:5’荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3’淬灭基团。3.如权利要求1-2所述的引物对及相应荧光探针，其特征在于所述荧光探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX，3’端的淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl、Eclipse、或TAMRA。4.一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的检测引物及其相应探针和/或括权利要求2所述的检测引物及其相应探针。5.如权利要求4所述的检测人HLA-B*5801等位基因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括如权利要求2所述内控引物对及相应荧光探针。6.一种人HLA-B*5801等位基因的检测方法，所述方法包括使用权利要求1和/或权利要求2所述的引物及探针。7.一种人HLA-B*5801等位基因的检测方法，所述方法包括使用权利要求4-5所述的试剂盒。8.权利要求1-2所述的引物及探针在检测人HLA-B*5801等位基因中的应用。权利要求书CN104404159A21/8页3用于检测人HLA-B*5801基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法技术领域[0001]本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于HLA-B*5801等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。背景技术[0002]人类白细胞抗原（HLA）是一组位于第6号染色体上的基因，是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，全世界已发现超过2700多种等位基因，虽然其中多少等位基因罕见。HLA基因是人类最复杂的遗传多态性系统，其多态性分布存在明显的族群特征。至今，来自中国大陆、香港、台湾和泰国的汉族人的研究表明，HLA-B*5801等位基因与药物别嘌醇导致的严重皮肤不良反应存在着很强的相关性。而在欧洲及日本人种中，其相关性则比较低。[0003]别嘌醇为次黄嘌呤氧化酶抑制剂,能够减少尿酸合成并降低血中尿酸浓度,是治疗痛风的首选药物。但该药引起的严重药疹临床屡见报道,是最易引起严重药疹的药物之一。有研究结果显示别嘌醇的不良反应主要表现为皮肤、黏膜损害,占不良反应的88.28%,其余部分57.81%为发热,约31.64%为肝脏损,20.31%为肾脏损害,9.77%则为血液系统损害。而别嘌呤醇引发皮肤变态反应致死率达40%HLA-B*5801等位基因如何引发别嘌醇导致的皮肤不良反应的药理学机制目前还不清楚，但由于携带高水平HLA-B5801等位基因者发生别嘌醇严重过敏反应的风险显著升高，仍然可以HLA-B*5801作为药物不良反应的标记物。因此，在开始别嘌醇治疗前，高危患者最好能检测该等位基因携带频率，尤其是在汉族人中。HLA-B*5801在汉族人的携带率高达~9%左右，痛风患病率在中国逐年上升，检测HLA-B*5801对减少药物不良反应，提高治疗效果有着重要意义。[0004]HLA等位基因有2700多种，分为A、B、C等基因族。中国汉人中，HLA-B等位基因大概有150种左右，HLA-B*5801的携带率达~9%，并呈区域性差异。等位基因间的差异在于多个编码氨基酸的SNP位点组成。[0005]目前，国内外对HLA-B*5801等位基因进行分析，大多采用PCR-SSCP、测序法（SBT）和荧光PCR法。测序法最为准备，但需要通过专业软件对测序结果进行分析，检测分析周期长。PCR-SSCP法是一种经典的方法，通过几对HLA-B*5801特异性引物扩增DNA并通过电泳结果来分析，污染风险大，周期长，不适合临床应用。现行的荧光PCR法，采用染料对扩增的特异片段产生信号，特异性较弱，而且无法进行PCR反应内控。发明内容[0006]本发明针对现有技术检测HLA-B*5801等位基因时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于Taqman实时荧光定量PCR技术平台的HLA-B*5801等位基因检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人HLA-B*5801等位基因。本说明书CN104404159A32/8页4方法针对临床检测的要求，引入PCR反应内控，保证检测反应的真实性和准确性。本发明快速、成本低，具有广泛推广价值。[0007]为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物及其相应探针，根据HLA-B*5801特异的等位基因多态性设计，序列如下所示：正向引物：HLA-B*5801F:5’-CACGGAACATGAAGGCCTCC-3’（SEQIDNo.1）；反向引物：HLA-B*5801R:5’-CGGAGGAGGCGCCCGTAG-3’（SEQIDNo.2）荧光探针：TM-HLA-B*5801:5’荧光基团-CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT-3’淬灭基团（SEQIDNo.3）。[0008]本发明还提供了一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的内控引物对及相应荧光探针，序列如下所示：内控引物对：正向引物：GAPDHF:5’-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3’（SEQIDNo.4）；反向引物：GAPDHR:5’-TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3’（SEQIDNo.5）；内控荧光探针：TM-GAPDH:5’荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3’淬灭基团（SEQIDNo.6）。[0009]上述检测人HLA-B*5801等位基因的探针和内控引物对应的荧光探针5’端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为BHQ1；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。[0010]本发明还提供了一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的荧光PCR试剂盒，包括本发明所述检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说，包括检测人HLA-B*5801等位基因的PCR反应液，其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下：（1）HLA-B*5801PCR反应液HLA-B*5801F：5’-CACGGAACATGAAGGCCTCC-3’；HLA-B*5801R：:5’-CGGAGGAGGCGCCCGTAG-3’TM-HLA-B*5801:5’荧光基团-CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT-3’淬灭基团上述试剂盒的PCR反应液优选方案中，除了包括检测人HLAB*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如下：内控引物：GAPDHF:5’-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3’说明书CN104404159A43/8页5GAPDHR:5’-TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3’内控荧光探针：TM-GAPDH:5’荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3’淬灭基团。[0011]上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：变性：温度为95℃，时间为20秒；退火延伸：起始温度为62℃，时间为45秒；第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：变性：温度为95℃，时间为20秒；退火延伸：起始温度为62℃，时间为45秒；（设置荧光信号采集）本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测HLA-B*5801等位基因的荧光PCR试剂盒进行HLA-B*5801等位基因检测的方法，步骤包括：（1）待测样品处理和模板提取a.从待检测者抽取血液样本；b.从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；c.测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/µl；OD260nm/OD280nm=1.6~2.0。[0012]（2）荧光PCR扩增：将待检测模板DNA与一定量的TaqDNA聚合酶加入含有本发明所述检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选将待检测模板DNA与一定量的TaqDNA聚合酶加入含有内控引物及相应荧光探针的上述试剂盒优选方案的PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，用以监测反应有效性。[0013]上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：变性：温度为95℃，时间为20秒；退火延伸：起始温度为62℃，时间为45秒；第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：变性：温度为95℃，时间为20秒；退火延伸：起始温度为62℃，时间为45秒；（设置荧光信号采集）（3）分析结果在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的HLA-B*5801等位基因为阳性。[0014]本发明还提供了一种检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针说明书CN104404159A54/8页6以及内控