3-蛋白质组学

ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/91蛋白质组学Proteomics医学分子生物学∙第三章ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/92主要内容3.1概述3.2蛋白质组学的研究内容和技术3.3蛋白质组学的研究意义及应用ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/93蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活动的实际执行者几乎所有的生物催化剂--酶，都是蛋白质。构成细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨；肌肉大部分也是由蛋白质组成蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链再折叠形成一定空间结构3.1概述ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/94Theeraof‘omics’-basedscience（组学时代）–Genomics（基因组学）–Post-genomicscience（后基因组时代）•Functionalgenomics（功能基因组学）–Transcriptomics（转录组学）–Proteomics（蛋白质组学）–metabonomics／metabolomics（代谢组学）•Structuralgenomics（结构基因组学）–Aim-3Dstructuresofallproteinfolds!3.1概述ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/95蛋白质组（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因组表达的所有蛋白质）：一种细胞在特定生理或病理状态下表达的所有蛋白质。1994年由澳大利亚科学家Wilkins提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质蛋白质组（原核生物和真核生物）3.1概述对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同在空间和时间上动态变化着的整体整体性、动态性和系统性ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/96蛋白质组学(proteomics):指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律.细胞器蛋白质组学：通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白质复合物组成来确定蛋白质在亚细胞结构中的位置。表达蛋白组学：把细胞、组织中的所有蛋白质建立成定量表达图谱或扫描EST图。蛋白质组学包括:ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/97虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为HumanProteinIndex计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念。国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。蛋白组学的发展简史ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/981996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA（美国食品药品管理局）共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。•英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。蛋白组学的发展简史ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/99我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/910•科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。•我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。•北京师范大学、中国协和医科大学、上海交通大学等八家院校和科研机构对外宣布，成立“高等学校蛋白质组学研究院”，成为我国向生命科学最前沿领域的蛋白质组学的研究迈出标志性的一步，为疾病早期诊断、药物精确筛选、发现疾病相关蛋白等有关课题提供突破性的解决方案，具有巨大的经济和社会效益。•2008年6月，引进大院名校项目：温州医学院－－高等学校蛋白质组学研究院联合实验室成立ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/9113.2蛋白质组学的研究内容和技术蛋白质组学研究的基本流程蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究技术ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/912Westernblot、免疫组化验证蛋白质并确定其定位根据氨基酸序列合成寡核苷酸探针，克隆基因蛋白质功能研究，包括蛋白质生物活性、抗体制备、蛋白质相互作用等方面蛋白质样品电泳前蛋白质样品的处理双向电泳分离Westernblot检测选择目标蛋白斑点，胶内酶切质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）获得肽质量指纹谱或肽序列标签数据库检索鉴定蛋白质电转印到膜上图像分析样品处理蛋白质分离蛋白质鉴定蛋白质组学研究流程图ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/913生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/9143.2.2蛋白质组学的研究内容1、蛋白质组表达模式（组成）的研究•蛋白质组成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质的发现、同源蛋白质比较、蛋白质加工修饰分析。2、蛋白质组功能模式（作用）的研究•基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析。•重要生命活动的分子机制（如细胞周期、分化与发育、环境反应与调节等）。•医药靶分子的寻找和分析（包括新药靶分子、肿瘤分子标记、人体病理介导分子等）。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/9153.2.3蛋白质组研究技术一、蛋白质组研究中的样品制备通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/916样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体、细胞核、细胞骨架等，用于蛋白质组研究样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/917蛋白质溶解性-分部提取法用不同的蛋白质提取液分部抽提细胞或组织裂解液，先用水溶液抽提，离心后的上清液中含大部分水溶性蛋白；再用对膜蛋白具有中等溶解度的提取液抽提沉淀，离心后上清液中含中等疏水性的蛋白质，包括膜表面蛋白和膜相关蛋白；最后用强溶解力的提取液抽提沉淀，得到疏水性强的蛋白质。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/918组织水平上的蛋白质组样品制备临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)：1996年基因公司发明能从临床病理切片标本中切下病变细胞，获得纯净的细胞群。可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/919ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/920二、蛋白质组研究中的样品分离双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/921•利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续pH梯度。•蛋白质是两性电解质，其pI有差异，电泳时分别聚焦于支持物上pH等于各自pI的区域。第一向：等电聚焦ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/922+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10第一向：等电聚焦ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/923第二向：SDS-PAGE电泳•SDS是阴离子表面活性剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的空间结构，并与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略电荷效应。因此，排除了蛋白质的电荷和结构差异，SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分子量所决定。•此外，在强还原剂（如巯基乙醇）存在下，可以打开蛋白质分子内或肽链之间的二硫键，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/924+–pH3pH7.5pH10chargesize第二向：SDS-PAGE电泳Proteinsmigratethroughthegelatarateproportionaltotheirsize.SmallestproteinstravelthefurthestdistanceZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/925双向电泳的流程双向电泳的流程主要包括：样品制备第一向等电聚焦第二向SDS-PAGE凝胶上蛋白的检测蛋白的软件的检测二、蛋白质组研究中的样品分离ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2020/7/926双向电泳特点可分离10～100kD分子