考马斯亮蓝法——完整版

TianjinMedicalUniversity天津医科大学药学院《体内药物分析》第三章——考马斯亮蓝法（Bradford法）徐亮[e-mail]一、基本原理酸性溶液两者结合，使染料溶液的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。二、试剂与器材1.试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。2.器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器三、操作方法1、标准曲线的制作试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl（ml）10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂（ml）5555555摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色A595nm以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug），在坐标轴上绘制标准曲线。2、样品中蛋白质含量的测定另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。四、Bradford法的优缺点1、优点（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。（3）干扰物质少。2、缺点四、Bradford法的优缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时最好选用γ—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。五、注意事项1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。六、思考题说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点？五种蛋白质测定方法比较如下：方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50～100g快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高～5g慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5g快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化