专题-PCR-添加剂

【专题】PCR添加剂简介1.3PCR添加剂研究概述PCR添加剂是PCR反应中的一种增效剂，它们在PCR反应中起到提高PCR反应的特异性、增加PCR扩增的产量及防止无效扩增等有益效果。由于PCR技术在有些情况下扩增的不完美性，从PCR技术发明的初期开始，人们就展开了对PCR反应中添加其它化学物质的研究。迄今为止，在PCR添加剂的研究领域，人们已经发现了越来越多的PCR添加剂，它们都以各自的特性在不同的方面对PCR反应起着促进作用。而随着PCR添加剂研究的不断发展，在各种相关研究中，人们逐渐从研究和应用单一型PCR添加剂转向研究和应用复合型PCR添加剂，从传统PCR添加剂的研究开发转向新材料新化合物PCR添加剂的研究开发。传统的PCR添加剂包括常见的助溶剂、离子化和非离子化的除垢剂以及一些诸如氯化四甲基铵（TMAC）、甜菜碱、SSB等。多年来人们对这些添加剂的研究表明，它们在一定的浓度范围内对某些PCR有着增效作用，但在另外一些情况下或在其它的浓度范围内对PCR反应又有着抑制作用，所以这些PCR添加剂的在不同反应体系中的应用应通过试验来调整和合理选择，合理准确的使用会使PCR反应获得很大的改善，从而得到试验所需要的理想结果。甜菜碱是一种高效的甲基受体，它在一些细菌体内对抵抗因盐份引起的渗透压升高起着重要的作用，其做为一种PCR添加剂，出现在Rees.W.A.[22]等人对甜菜碱降低DNA的Tm所做的研究之后。甜菜碱广泛存在于多种酶以及PCR试剂盒中，它能提高PCR扩增的效率和特异性，特别是在长PCR（Long-PCR）扩增时常被应用[23]。Barnes[23]指出，在Long－PCR中添加甜菜碱能够使每个循环的热变性温度下降到92℃～93℃，且退火温度也可以下降1℃～2℃，从而补偿因退火条件变化及因其它添加剂引起的酶稳定性下降引起的PCR反应的负面效果。另外，他还指出甜菜碱不仅能促进高GC含量片段的扩增，而且能提高普通的PCR扩增的目的产物量[24]。甜菜碱另外一个优点是，作为一种渗透保护剂，它具有和牛血清白蛋白（BSA）类似的功能，能够防止聚合酶的变性[24]。把Long－PCRBuffer中的BSA换成甜菜碱将有利于减少弥散问题的发生。甜菜碱也有可以克服DNA少量污染带来的扩增困难，这意味着PCR反应可以在低质量模板存在的情况下进行[25]。氯化四甲基铵（TMAC）最早被用于在杂交反应中减少DNA／RNA的错配以提高特异性[26]，在PCR反应中，它能够增加PCR反应的效率和提高PCR反应的特异性。在TedHung等人[27]首次发现TMAC提高PCR反应特异性的研究中，他们选择了两个mousecDNA的基因片段进行扩增实验。结果显示，含有1×10-5～1×10-4MTMAC的实验组扩增结果在电泳图上只出现一条单一的目的条带，而未含有TMAC的实验组特异性非常差，有多条非目的条带出现。EricChevet等人[28]在研究中还发现，通过添加TMAC可以提高AT含量丰富的DNA片段的Tm，从而通过改善引物的特异性结合来提高PCR反应的特异性。在研究中，他们实验了不同浓度的TMAC促进PCR反应的效果，发现TMAC的最佳添加浓度为60mM。他们的研究还表明，TMAC不仅可以提高PCR反应的特异性，而且可以提高PCR反应的效率，三对引物的扩增实验均发现添加TMAC可以提高PCR目的产物产量5～10倍。单链结合蛋白（SSB）是活的生物体中不可缺少的重要物质，它非特异性的和单链DNA结合，参与所有涉及到单链DNA的诸如复制，修复及重组等过程[29]。这种体内DNA复制过程中SSB所起到的重要作用，自然引起了人们对SSB在PCR这一体外DNA复制技术中应用的可行性考虑。Rapley等人[30]在1994年首次就SSB在PCR中的应用做了专门研究。他们研究发现T4噬菌体基因32编码蛋白及大肠杆菌单链结合蛋白对数种模板的PCR反应均有提高效率的作用。由于PCR反应是一个不断的热循环过程，因此嗜热源SSB是PCR添加剂的理想来源，这一点在近年来的研究中得到了证实。Dąbrowski等[12]就曾克隆Thermusaquaticus和T.thermophilus的SSB编码基因并让它们在E.coli中过表达，随后进行的TaqSSB及ThSSB在PCR中的添加实验表明它们均能很好的提高PCR反应效率。之后不久，Perales等人[13]表达纯化了三种类型ThSSB，在Th聚合酶和Pfu聚合酶的PCR体系中所做的实验发现ThSSB可以使PCR延伸的时间减半，而且在无校正功能的Th聚合酶PCR体系中的实验进一步表明ThSSB可以增加PCR反应的保真度。而Olszewski等人[14]在multiplexPCR实验中对TaqSSB的研究发现其可以防止或减少引物二聚体的形成，从而有效提高PCR反应的效率和特异性。甲酰胺（Formamide）是被较早发现并广泛应用的PCR添加剂之一，它能显著性的提高PCR反应的特异性[8]。为了开发新的更高效的PCR增效剂，RajCharabarti等人[31]对与甲酰胺结构类似的低分子量的胺类化合物在PCR中的应用做了专门的研究。在RajCharabarti等人的研究中，包括甲酰胺在内的与甲酰胺结构类似的共四大类10种低分子量胺类化合物做了PCR反应添加实验。实验结果表明，acetamide对中等GC含量的片段扩增有非常好的效果，而对高GC含量的片段却并不是这样；2-pyrolidone对多数基因片段都有特别好的增强扩增的效果，特别是在高GC含量的扩增中表现除很好的效果。DMSO是也是一种较早被发现的且广泛应用的PCR增效剂。P.R.Winship[5]、B.Bachmann[32]等较早对DMSO在PCR产物测序中能有效降低DNA链的复性做过报道，随后D.Pomp[33]，G.Sarkar[8],Filichkin.S.A.[34]及SunY[35]等人对DMSO在PCR中的应用做了进一步的研究，虽然他们的报道中都指出DMSO能够全部或部分的提高PCR反应的特异性，但各自报道的有效作用浓度都有很大差别，添加量从0.9％到15％不等，过高浓度的DMSO均能抑制PCR反应。肖志壮[36]等人就过量DMSO抑制PCR反应及降低PCR扩增的特异性的现象在所实验的PCR模型上做过专门的研究并提出了应对的策略，他们的研究表明，在10%DMSO的反应体系中，引物浓度为7.5×10-7mol/L时，模板浓度提高到1.6×10-10mol/L即可完全避免非特异扩增。值得注意的是，10%DMSO存在时，如果引物浓度降低至7.5×10-8mol/L，则看不到特异产物，也就是说，反应体系含DMSO时，需增加引物浓度，保证PCR特异扩增。因此，DMSO用于PCR时一定要注意平衡模板、引物及DMSO的浓度，这一点值得我们在应用DMSO的PCR实验中加以注意。鉴于DMSO在优化PCR反应中所起的效果且同样为了开发新的更高效的PCR添加剂，RajCharabarti等人[37]还对其它几种水溶性亚砜类化合物在PCR中的应用做了相应的研究，以期判断它们是否也具有同样的优化PCR反应的效果。在实验中，他们选用了三种高GC模板PCR模型，就DMSO、methylsec-butylsulfoxide,n-propylsulfoxide,n-butylsulfoxide,andtetramethylenesulfoxide等五种亚砜类化合物优化PCR反应的分别做了测试。在这五种测试的亚砜类化合物中，methylsec-butylsulfoxide为唯一一种分子结构呈不对称性的化合物，tetramethylenesulfoxide为唯一一种分子结构含环形功能团的化合物。在三种高GC模板模型中，牛脑GTPcDNA（660bp,58%GC）模板为主要受测模型，所有五种亚砜类化合物首先在这个模型上进行测试。结果表明，除添加n-butylsulfoxide的实验组未出现任何目的产物外，其它四种被测化合物均有表现出很强的提高PCR反应特异性的效果，且对应得到目的产物均有很高的产量。具体效果效果为：tetramethylenesulfoxide为效果最佳，methylsec-butylsulfoxide次之，接下来是n-propylsulfoxide，DMSO以其只能获得所有产物中89％的特异性产物而居最后。在产量上，添加tetramethylenesulfoxide，methylsec-butylsulfoxide及n-propylsulfoxide后的实验组为添加DMSO实验组的2～3倍多。而在接下的来实验中，对剩下四种化合物，同样以牛脑GTPcDNA（660bp,58%GC）模板为模型实验了的各种化合物的有效作用浓度范围，实验结果表明，tetramethylenesulfoxide的有效作用浓度范围为：0.28～1.0M，methylsec-butylsulfoxide的有效作用浓度范围为：0.03～0.31M，n-propylsulfoxide的有效作用浓度范围为：0.15～0.36M，DMSO的有效作用浓度范围为：0.75～1.25M。在996bp人骨髓白细胞c-juncDNA(64%GC)模型上所做的进一步测试表明，变性温度为95℃时，tetramethylenesulfoxide相比于DMSO有较好的作用效果，而propylsulfoxide相比于DMSO则效果较差；变性温度为92℃时，tetramethylenesulfoxide则为唯一有效的添加剂。而在511bp人PSMcDNA(52%GC,158bp73%GC片段)模型上的测试再一次证明tetramethylenesulfoxide为最有效的添加剂，DMSO次之，propylsulfoxide居最后。和作者稍早前基于相同的出发点对系列砜类化合物作为PCR添加剂所做研究的结果对比分析可知[38]，虽然methylsulfone比DMSO的效果稍好，但亚砜类化合物总体来说作用效果要好于砜类化合物。作者进一步的比较分析指出，这种在PCR反应中不同亚砜类化合物间所表现出的不同效果是有一定的化学式上的结构依赖性的，同比来说环状结构的砜类、亚砜类及胺类化合物作用效果明显优于其它结构的化合物。有研究者认为DMSO提高PCR反应的特异性是由于其于模板DNA的大沟和小沟结合并破坏其双链结构，在这里，作者认为环状结构化合物的独特作用效果可能是由于其破坏了模板DNA大沟和小沟里带有供体和受体互补氢键的理想构象，也有可能其通过限制DNA链的自由旋转而使得DNA骨架的相邻基团间位间排斥减小。新型高效是以上从结构类似化合物中筛选新PCR添加剂的出发点，近年来，复合型PCR添加剂的开发更是朝这各目标又迈进了一步。所谓的复合型添加剂就是把两种或两种以上的PCR添加剂通过一定的比例混合在一起形成的新型PCR添加剂，和单一PCR添加剂相比，其促进PCR的效率更高。N.Baskaran等人[39]的报道中，实验了四种不同的片段的PCR，其中两个高GC片段（64％和80％），两个非高GC片段（44％和52％）。当在同一个体系中同时扩增四个片段时，实验表明1.0M的甜菜碱结合6％～8％DMSO及5％DMSO结合1.2～1.8M的甜菜碱能很好的同时扩增出四种目的片段，虽然高浓度的DMSO及高浓度的甜菜碱在也能扩增出某种或某几种片段，但四种目的片段的产量均衡性比不上甜菜碱和DMSO组成的复合型添加剂。最近，J.Kang等人[7]在随机序列DNA文库的同步PCR扩增试验中也同样发现1M的甜菜碱结合5％DMSO能改善PCR扩增的效果。相比于以上两种PCR添加剂组成的简单复合型添加剂，M.Ralser等人[40]及M.Musso等人[41]则相继报道了三种以上PCR添加剂组成的复合型添加剂。MarkusRalser等人对其混合配置形成的含有甜菜碱，DMSO，DTT及BSA四种物质的复合型添加剂在12对引物(GC含量61％～75％)扩增实