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手足口病的病原学及其诊断许文波中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家麻疹/脊灰实验室2009-03-30“阜阳13例不明原因肺炎死亡病例”•病例高度散发•不具有传染性，可能为感染性疾病•没有疹子或疹子不典型•以“重症肺炎”为主要临床表现•病情进展迅速，大部分入院几小时-2天死亡•病因不明•EV71感染中枢神经系统引起的心肺衰竭“疫情概况”阜阳不明原因肺炎死亡病原学鉴定4月18，中国CDC组织专家组流行病学临床资料实验室检测EV71是此次疾病的主要致病原证实4月23日分析判定病原和实验室检测方向为=HEV71手足口病第38种需上报的传染性疾病•2008.05.02手足口病皮疹分布1.颊粘膜和手指;2.手掌3.足底4.唇粘膜5.咽峡炎123452008年中国大陆手足口病报告人数•总共报告489073例病例，发病率为37.01/100,000–严重病例1165例，占报告病例数的0.24%–死亡126例，死亡率为0.0095/100,000，死亡病例占总病例0.26‰传染病疫情网络数据库统计分析人肠道病毒简介和分类•小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要在肠道内复制,但可感染各个系统和器官。•单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。•小球形病毒（~30nm），20面体对称结构。•衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面，VP4与内部RNA结合。•与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。•在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。•引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。CourtesyofLindaM.Stannard,UniversityofCapeTown,S.A.h~30nm二十面体对称无包膜人肠道病毒的毒粒结构•脊髓灰质炎病毒：通过将标本接种至猴子体内，1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。•柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。•埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。•新肠道病毒：后来，新发现的病毒被按照序号命名（69~71），最近，已经命名至102型人肠道病毒发现的历史人肠道病毒传播方式粪-口途径传播:唾液与粪便呼吸道传播:空气飞沫接触传播:环境因素影响经水传播的病原体河流海洋排毒水海产品污水处理厂休闲、娱乐直接、间接接触（院内）灌溉盘子门把手洗针对脊灰病毒、NPEV、轮状病毒、诺如病毒，甲肝手足口病（hand-foot-mouthdisease，HFMD）•为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。1957年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原；1959年提出HFMD命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71引起的手足口病流行。–发热,不适,咽喉肿痛,口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡•传染性极高•病程约1周HFMD的病原手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括CoxA5,A10,A16,A19,EV71,以及部分埃可病毒和柯萨奇B组病毒,以CoxA16和EV71最为常见传播途径:粪-口途径传播:唾液与粪便;呼吸道传播:空气飞沫;接触传播疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布,但近年EV71在东南亚一带流行,引起较多的重症和死亡病例。在80年代和90年代，中国手足口病的流行主要以CoxA16为主，2008年，CoxA16和EV71共循环引起手足口病爆发,EV71在大部分省市为优势病毒。肠道病毒CoxA16•1957年在加拿大首次报告HFMD，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原；•1959年提出HFMD命名，之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒等引起的手足口病属于小RNA病毒科，肠道病毒属，A组肠道病毒。1972年EV71在美国被首次确认，1974年Schmidt等首次发表从美国加利福尼亚州20例具有中枢神经系统症状患者（1969~1973年）中分离到EV71。随后，世界上众多国家都有EV71流行的报道。EV71感染可引起HFMD、疱疹性咽峡炎、无菌性脑炎、脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹，但更多情况下是产生隐性感染。同脊灰病毒相似，EV71对脊髓前角细胞具有一定的组织嗜性，是最常见的引起急性迟缓性麻痹（acuteflaccidparalysis，AFP）的非脊灰肠道病毒（non-polioenterovirus，NPEV）,EV71潜伏期一般为3－7天。感染EV71后，患者发病1~2周内可自咽部排出病毒，从粪便中排毒可持续至发病后3~5周。疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）虽然EV71最初分离于具神经系统症状患者，曾在澳大利亚、欧洲、亚洲和美国引起严重神经系统疾病，而近年来，EV71则多与HFMD的暴发相关，并在暴发中引起患者神经系统症状，甚至死亡。1975年保加利亚44个婴幼儿死于HFMD20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4～8月共有2628例发病，仅4～6月就有29例病人死亡，死者平均年龄1.5岁。1998年我国台湾省发生EV71引起的手足口病和疱疹性咽峡炎暴发流行，在6月和10月两波流行中，共监测到129106例，重症病人405例，死亡78例，死亡病例大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性迟缓性麻痹和心肌炎等。人肠道病毒感染的一般致病机制进入途径口腔/呼吸道咽喉及下肠胃道传播扁桃体、深层淋巴结、肠道淋巴结微病毒血症先天性感染神经系统心脏肝脏、胰脏、肾上腺呼吸系统皮肤及黏膜病毒血症神经系统抗体产生、病毒血症消失，病毒感染症状改善飞沫、接触、饮食肌肉①隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。②病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。③不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。④感染过程中形成病毒血症。致病特点中国HFMD的流行•1981年，我国在上海首次报道了HFMD病例•1987年在中国分离到CVA16•1995年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的HFMD患者中分离到EV71病毒。•2007年，山东发生了手足口病爆发流行，累计报告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。实验室检测发现EV71是引起山东临沂HFMD的主要病原，同时还检测到Echo3和/或CVA16。•2008年全国出现HFMD爆发流行,以HEV71为优势,CVA16还有其它EV共循环引起EV71毒株各个基因型/亚型流行的地理和年代分布基因型流行地区流行时间A美国1970B1美国、澳大利亚、中国台湾、匈牙利、保加利亚、日本1972~1987B2美国、1981~1987B3马来西亚、澳大利亚、新加坡1997~1999B4马来西亚、新加坡、中国台湾、日本1997~2002B5马来西亚2003C1美国、澳大利亚、马来西亚、新加坡、越南、泰国、日本1986~2005C2美国、澳大利亚、日本、中国台湾、1995~2002C3中国、韩国1997、2003C4中国、越南、日本、中国台湾1998~2007C5越南2005（一）粪便标本采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（二）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（三）血清标本采集急性期(发病0～5天)和恢复期(发病14～30天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集(发病7～20天)血。静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。标本采集种类、运输和保藏-HFMD（四）咽拭子标本采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（五）疱疹液可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。手足口病病例标本采集要求病人类型标本类型采集时间样本量保存运送死亡病例脑干组织肺组织等血液死亡后不低于20克血液不低于2ml-70C冷藏重症、轻型病例血清急性期（5天内）1ml-70C冷藏发病后5～15天1ml发病3周后1ml咽拭子急性期1ml粪便急性期1份疱疹液有疱疹时1份备注：（1）采集新发或新入院病人的相关标本；（2）样品采集时，如果标本需分装或分地检测，注意适当增加单份样品采集量；（3）采样时，做好样品登记工作，详细记录病人姓名、性别、年龄、发病时间、出疹时间，采样时间、主要临床表现、是否用药等信息，并注意和个案调查资料相匹配。•用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液•如果患者出现神经系统症状，应该采集脑脊液标本。•在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒具有很高的诊断价值。•用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。•为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。•不能立即检测的标本应冷冻保存。•对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病2-4周后采集。标本采集注意事项加强HFMD病原检测和监测的十分必要•依据台湾1998-2008和中国大陆2007-2008年的经验•掌握手足口病病原谱，特别是EV71感染所占的比例，对分析判断HFMD疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。1.1998年台湾手足口病暴发疫情中，在48.7%轻症病例中、75％住院病例中、92％死亡病例中均分离到HEV71。2.2007年山东临沂发生了手足口病暴发，有8例死亡病例，手足口病的病原谱构成中，HEV71约占84%，CVA16约占16%；2008年当地手足口病病例数仍较高，但病原谱发生较大的变化，病毒毒株是以CVA16为主（占62％）,并且没有重症死亡病例。3.2008年阜阳HEV71手足口病99％以上有是手足口病的病原构成比例(实验室EMAIL统计)050100150200250300350400456789101112monthcasenumber0102030405060708090100EV71proportionofconfirmed％unconfirmedotherEVEV71CoxA16EV71percentofla