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R1.iQ™5多重实时荧光定量PCR仪简介在现代分子生物学的发展过程中，核酸放大技术的出现及与之相关的检测技术的成熟起到了至关重要的作用，而实时荧光定量PCR技术可以说是两者完美的结晶。它通过加入能与DNA结合的荧光染料或在引物/探针上标记荧光基团等方法，在PCR过程中，随着产物的量不断增加，荧光信号也随之发生相关性的变化，再通过数学处理，算出原始靶DNA的含量。实时荧光定量PCR技术可以在较大的动力学范围内实现精确定量，其灵敏度也达到相当高的程度。随着这项技术的发展，其专用的实时荧光定量PCR仪也应运而生。我们伯乐公司这次推出的iQ™5多重实时荧光定量PCR仪是在iCycler荧光定量PCR仪的基础上强化而成，以求性能达到最优。iQ™5多重实时荧光定量PCR仪所装配的光源（钨卤素灯）拥有更宽的光谱范围，给予用户在其选择上最大限度的灵活性。经过优化的激发/发射透镜组可以显著提高多重PCR的灵敏度，减少多重荧光之间的干扰。它的CCD检测器可以同时监测96个反应孔的荧光数据。在热循环过程中，当前完整的实验数据会被软件实时地以图解的形式表现出来。实时的数据显示可以大大提高反应孔与孔之间数据比较的可靠性，iQ™5多重实时荧光定量PCR仪则可以方便地实现数据实时显示，有利于及时反馈试验状况。以上介绍的各项特性保证了iQ™5多重实时荧光定量PCR仪在使用过程中具有更强的可靠性和灵活性。iQ™5多重实时荧光定量PCR仪所配备的运行、分析软件设计得十分人性化，且功能强大。其功能模块的界面模式可使用户可以快速地完成各种操作。当用户把光标放在软件的功能键上时，其下方还会出现相应说明文字。此外，按键盘的“F1”键还可以启动在线帮助指南。当用户设定完结果分析参数后，点一键即可得到最终分析结果。RR2.iQ™5使用快速指南2.1如何用iQ™5运行一次实验2.1.1综述1.创建、选择或修改一个反应程序文件（Protocolfile）2.创建、选择或修改一个反应板设置文件（PlateSetupfile）。3.点击“Run”键。4.以选定的反应板设置文件和反应程序文件进行反应。2.1.2反应程序文件（Protocolfile）设置指南用户可以在Workshop模块中，创建一个新的反应程序文件，或是直接选择或修改一个已有的反应程序文件。2.1.2.1选择一个已有的反应程序文件1.点击“Protocol”键，在弹出的浏览器中选定所要选择的反应程序文件的路RR径。2.点击所需的反应程序文件的文件名，此时该文件的具体设置在“SelectedProtocol”窗口中显示出来。注意：iQ™5软件安装后，里面会自带一些我们设置好的反应程序文件作为示例，用户可以直接调用它们。2.1.2.2创建或修改一个反应程序文件在“SelectedProtocol”窗口点击“Edit”键即可对当前的反应程序文件进行修改；在“SelectedProtocol”窗口点击“CreateNew”键即可创建一个新的反应程序文件。无论点击“Edit”或“CreateNew”键，软件都会自动切入“ProtocolEdit”窗口。RR这个窗口下部有一显示反应内容的表格，用户可以在其中按自己的需求进行修改。1.修改保温时间和保温温度。“DwellTime”列设置保温时间，“Setpoint”列设置保温温度。如果用户要设置一个10秒的保温时间，那就要在相应格中输入0：10或者0.10。2.选择荧光数据收集步骤“DataAcquisition”列用于设置荧光数据收集步骤。其中“Real-Time”选项用于荧光定量，“MeltCurve”用于熔点曲线分析。注意：如要进行荧光PCR实验，必须保证程序中至少有一个荧光数据收集步骤。3.插入循环或步骤在表格中“Cycle”列有数字显示的行，点击该行“Insert”列的“+”，即可完成循环插入，系统默认插入的循环在当前循环之后。在表格中“Step”列有数字显示的行，点击该行“Insert”列的“+”，即可完成步骤插入，系统默认插入的步骤在当前步骤之后。4.删除循环或步骤点击某Cycle行“Delete”列的“×”，即可将该循环删除。点击某Step行“Delete”列的“×”，即可将该步骤删除。5.文件保存点击“SaveandExitProtocolEditing”键，在随后出现的“Saveas”对话框中输入程序文件的名称，再点击“Save”键即可完成保存。注意：点击“SaveandExitProtocolEditing”键或“CancelandExitProtocolEditing”键才能退出“ProtocolEdit”窗口。2.1.3反应板设置文件（PlateSetupfile）设置指南1.在Workshop模块中，用户可以：a.点击反应板设置文件显示区的“CreateNew”键创建一个新的反应板设置文件；b.点击反应板设置文件显示区的“Plate”键，在浏览器中选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，即可选中该文件；RRc.点击反应板设置文件显示区的“Plate”键打开浏览器，选择想要的反应板设置文件的路径并双击其文件名，再点击“Edit”键即可对该文件进行修改；d.点击“DataFile”键，在随后出现的浏览器中选择数据文件。点击其文件名即可打开其关联的反应板设置文件，再点击“Edit”键即可对其进行修改。2.在“Notes”栏中输入或修改对该文件的说明。3.在样品体积（SampleVolume）、封板类型（SealType）、反应容器类型（VesselType）各项设置中输入或修改相应内容。4.输入或修改文件名。5.点击“Select/AddFluorophores”键选择本次实验所要使用的荧光染料种类，在软件中每种选中的荧光染料都会用一独特的图标表示。6.如果“WholePlateLoading”显示在取消状态，请选择该选项选项。注意当用户修改一个反应板设置文件时，该选项为不可用。7.点击某一样品类型图标。8.用点击或拖曳来设定该样品类型对应的反应孔。9.点击某一荧光染料图标。10.用点击或拖曳来设定该荧光染料对应的反应孔。11.重复以上7~8两个步骤，直到所有反应孔第一荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。12.如要取消某孔此前的所有设置，点击“DeleteAll”键，再点击该孔。13.如要取消某孔此前的荧光染料设置，点击“DeleteFluorophore”键，再点击该孔。14.如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“DilutionSeries”键可设置其原始靶核酸数量。以上为所有反应板设置文件共通的部分，根据反应板设置文件对应类型不同，以RR下的步骤有所区别。a.单色荧光检测（Single-ColorExperiments）15.点击“Save&ExitSetup”键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后縀为“.pts”的文件形式保存。b.多色荧光检测并启用“WholePlateLoading”选项（Multi-ColorExperimentswithWholePlateLoadingSelected）15.点击第二荧光染料对应的图标。16.如要取消当前选择的第二荧光染料，点击“DeleteFluophore”图标并点击相应反应孔。17.点击“PaintCan”图标。18.用点击或拖曳来设定第二荧光染料对应的反应孔。19.重复7~8两个步骤，直到所有反应孔第二荧光染料对应的样品类型全部设置完毕。20.重复15~19的步骤，把第三、第四荧光染料设置完毕（如有需要）。21.点击“Save&ExitSetup”键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后縀为“.pts”的文件形式保存。c.多色荧光检测并不启用“WholePlateLoading”选项（Multi-ColorExperimentswithWholePlateLoadingDeselected）15.点击第二荧光染料对应的图标。此时会显示所有反应孔对应第一荧光染料会显示，但其样品类型不会显示。同样在设置第三及第四荧光染料时，此前的荧光染料对应的样品类型也不会显示。]16.如要取消当前选择的第二荧光染料，点击“DeleteFluophore”图标并点击相应反应孔。17.点击某一样品类型图标。18.用点击或拖曳来设定第二荧光染料及该样品类型对应的反应孔。19.重复17~18两个步骤设置其他反应对应第二荧光染料的样品类型。RR20.如要某些反应孔第二荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“DilutionSeries”键可设置其原始靶核酸数量。21.重复15~20的步骤，把第三、第四荧光染料设置完毕（如有需要）。22.点击“Save&ExitSetup”键，在随后出现的对话框中设置文件名并进行保存。该文件会以后縀为“.pts”的文件形式保存。2.1.4反应运行指南点击“Workshop”模块的“Run”键，软件即会切入“Run-TimeCentral”模块的“InitiateRun”界面。2.1.4.1开始运行一次反应1.在“InitiateRun”界面选择所要使用的反应程序文件和反应板设置文件。2.选择孔间差异因子计算方式。3.点击“BeginRun”键。4.在弹出的“SaveOpticalDataFile”对话框中输入数据文件的文件名。5.点击“OK”键。2.1.4.2反应运行实时监控在反应运行开始后，软件会切入“MonitorRun”界面，在这里会实时显示反应状况。在反应结束后，会自动弹出“RunStatus”对话框。RR如点击“Yes”，软件会切入“DataAnalysis”模块显示本次反应的数据。如点击“No”，软件会退回“Workshop”模块。2.2数据分析指南2.2.1综述“DataAnalysis”模块的主要功能就是让用户进行实验数据分析。当用户刚打开iQ™5软件时，“DataAnalysis”模块的切换键显示为灰色不可选。用户只有通过“Workshop”模块的“DataFile”界面选择一数据文件后点击“Analyze”键，即可进入“DataAnalysis”模块。“DataAnalysis”模块分为以下六个功能界面：PCRQuant：顾名思义，该界面是用于PCR定量分析的。用户可以在这里定义本底、临界阈值等等参数从而计算出每孔靶DNA的原始值，而根据标准曲线计算出的各孔PCR效率也会在这里显示出来。同时，本界面也为下面EndPoint、GeneExpr和AllelicDisc等界面工作提供必要的数据。MeltCurve/Peak：该界面用于分析双链DNA的熔点温度（Tm值）。用户可以通过加入能与双链DNA结合的荧光染料（比如SYBRGreenI等）或荧光标记的杂交探针进行反应，再用该界面进行分析。EndPoint：终点法分析，它通过样品相对荧光读数（RalativeFluorescenceUnit，简称RFU）终值来对样品的阴、阳性进行定性判断。AllelicDisc：该界面可以通过与已知基因型样品的数据进行比较得到未知样品的基因型结果。用户可以通过临界循环数或RFU来确定样品是野生纯合子、变异纯合子还是杂合子。GeneExpr：该界面可以提供一些分析工具用于基因表达分析。它既可以让目标基因和其他基因的表达进行比较，也可以将目标基因不同时期或不同生长环境之间进行比较。EditPlate：在这个界面里，用户可以对反应板设置文件中的各孔的反应类型进行修改，也可以对标准品对应的原始靶核酸量进行修改。这样，万一用户在实验运行前设置发生错误的话，在这里可以很方便地进行修改。注意，如果用户在这里修改后，原始的反应板文件并不会被覆盖。RR2.2.2PCRQuant界面设置指南“PCRQuant”界面主要的功能是设置本底和临界阈值等参数来进行PCR定量计算。当这些参数设置完成后，软件就会自动分析出每孔样品的临界循环数。如果用户之前设定了标准品，那么此时软件还会计算出其他各孔样品的原始靶核酸