β-内酰胺类抗生素高分子聚合物

β-内酰胺类抗生素高分子聚合物山东省药品检验所张雷一.高分子聚合物的研究•（一）β-内酰胺类抗生素高分子聚合物的定义与分类•1.定义•药物中的高分子聚合物系指药物中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分子量一般在1000～5000，个别可至10000道尔顿左右。•2.来源与分类•β-内酰胺类抗生素药物中的高分子杂质按其来源可分为两类：外源性杂质与内源性杂质。•2.1外源性杂质：一般来源于发酵工艺，为蛋白、多肽、多糖等杂质或与抗生素结合的杂质。如：青霉素中的青霉噻唑蛋白，青霉噻唑多肽。•2.2内源性杂质：系指抗生素药物自身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存过程中形成；甚至在用药时也可以产生，如阿莫西林颗粒。•随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，故对内源性聚合物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。•（二）β-内酰胺类抗生素高分子杂质的形成机理及结构特征•β-内酰胺类抗生素主要包括青霉素和头孢菌素两大类。RCONHCHNSCH3CH3COOHO1R2CH2COOHNSONHCHCOR•除青霉素G和V外,临床中常用的β-内酰胺类抗生素均为半合成抗生素,故除青霉素G和V中还含有少量的青霉噻唑蛋白外,其他制剂中的高分子杂质主要是聚合物。•1.青霉噻唑蛋白，多肽•制剂中青霉噻唑蛋白，多肽的分子量主要分布在2400～3500，由青霉素的β-内酰胺环和多肽上的伯氨基按亲核反应机理缩合而成，主要在发酵工艺中形成，高pH环境有利于缩合反应的进行；样品在储存过程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍能和β-内酰胺环反应，直至饱和。1.青霉素聚合物青霉素的聚合反应可按两种方式进行：（1）反应仅和母核结构有关，侧链中的活性基团不参与反应。CONHCHNSCH3CH3COOOO-COCOOCH3CH3NS--CONHNHCO-NSCH3CH3COOOCHn（1）侧链参与的聚合反应主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链的氨基亲核攻击β-内酰胺抗生素的羰基碳原子，形成聚合物。CONHCHNSCH3CH3OHCOO-CNHCHNH2CHC-COOHOCH3CH3NSNHCHCOCONHCHNSCH3CH3OCOOCCHNHH1.头孢菌素的聚合反应也包括两种类型：只依赖于母核的N型聚合反应和侧链参与的L型聚合反应。对于7位侧链中不含有自由氨基的头孢菌素只能发生N型聚合反应。(三)β-内酰胺类抗生素质量和过敏反应的关系引发过敏反应的过敏原a.分子量大b.具有一定抗原决定簇青霉素过敏反应中主要抗原决定簇——青霉噻唑基（BPO）头孢菌素过敏反应中主要抗原决定簇——7位R1侧链c.多价RCONHCHNSCONHHCH3CH3COOHβ-内酰胺类抗生素本身并不是过敏原，而只有当它们与蛋白、多肽、多糖等大分子载体共价结合成全抗原或本身聚合成多价半抗原后才能引发过敏反应。（四）.影响聚合物形成的因素1.青霉素的聚合物青霉素的聚合物反应速度在液体条件下和溶液的酸碱度关系密切；在固体条件下主要和样品的水分含量有关。2.头孢菌素的聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度关系密切，试验表明，贮存温度较低时，含水量差异堆聚合物含量尽管有影响，但影响不大。但当贮存温度上升至37摄氏度时含水量差异对聚合物含量的影响十分显著。3.工艺不同如氨苄青霉素有溶媒结晶和喷雾干燥两种，一般后者的聚合物要明显多于前者。（五）.口服青霉素类药物使用前进行皮试的必要性口服青霉素，如青霉素V钾与其他注射用青霉素一样可以形成高分子聚合物，其聚合速度与药物浓度、反应温度及pH等有关。制备的青霉素V聚合物的豚鼠皮肤被动过敏试验（PCA）阳性，口服青霉素V高聚物后，30分钟血清中可检出高聚物；在30分钟到1小时可引发豚鼠PCA反应阳性，从而证明青霉素中高分子聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应。二.高分子杂质分析方法（一）概述：国内外已有许多分离、分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的报道。色谱法是主要分离分析的方法。其分离模式有三类：（1）反相模式（2）离子交换模式（3）凝胶色谱模式由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性，因此，在药品质量控制中一般不需分别控制不同结构的高分子杂质含量，而只需控制商品中高分子杂质的总量。故根据分子量差异进行分离的凝胶色谱模式是简便易行的分离模式。（一）凝胶色谱分析法的原理：1.分离原理利用凝胶色谱的分子筛机制，让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻不能进入，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱。2.凝胶介质根据β-内酰胺类抗生素和其高分子杂质分子量的特点，比较数种凝胶介质，最后选用SephadexG-10作为凝胶介质（排阻分子量在1000道尔顿左右）。（一）分析方法1.系统适用性试验为保证不同实验室间测定的精密度符合规定，要求方法系统适应性参数：理论板数及拖尾因子：用蓝色葡聚糖2000的溶液（1mg/ml）作为参比溶液，测定在流动相A、B中的Kav＝0的保留时间，并计算出理论板数及拖尾因子。在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间比值应在0.93～1.07之间，对照溶液主峰与供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间比值应为0.93～1.07。药物分子和凝胶介质间的相互作用和药物的结构有关。其色谱分析受色谱条件如：流动相的组成、浓度、pH、流速等因素的影响。所以可通过改变色谱调节调节药物分子和凝胶介质间的相互作用，使高分子杂质和药物分子间的分离良好，通过对流动相与洗脱速度的优化，已成功建立数十种β-内酰胺类抗生素高分子杂质的分析方法。2.自身对照的外标法由于β-内酰胺抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，高聚物本身不稳定，不易制备。用高聚物本身作为对照的外标法定量有一定难度。同时由于高分子杂质含量较低，进样量一般相对较大，是药物本身色谱峰十分宽大，导致主峰的峰面积积分误差较大，因此也限制了面积归一化法的应用。试验证明，在特定条件下，β-内酰胺抗生素可缔合形成表观分子量较大的缔和物，缔和物在SephadexG-10凝胶色谱系统种色谱行为与高分子杂质一样，都在Kav＝0处表现为单一色谱峰，利用这一特点，在SephadexG-10凝胶色谱系统种制定了新的定量方法——自身对照外标法。三．2005年版β-内酰胺类抗生素高分子聚合物法增修订概况（一）.修订内容1.对原收载的8个品种的色谱条件与系统适用性试验均与新增品种项下书写格式相同。2.系统适用性试验：统一为理论板数以蓝色葡聚糖2000峰计算均不低于…。拖尾因子均应小于2.0，在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间比值均应在0.93～1.07之间；对照溶液主峰与供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值均应在0.93～1.07。3.对照品溶液修改为对照溶液4.头孢他啶聚合物项下，流动相A由原来的含3.5％硫酸铵的pH7.0的0.01M磷酸盐缓冲液修订为含3.5％硫酸铵的pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液。四.操作要点(一).色谱条件中流动相A的组成与浓度，pH值及流速对测定结果的影响。1.流动相的组成与浓度：本方法流动相为磷酸盐缓冲液。用不同浓度的磷酸盐缓冲液作为流动相时，药物分子的色谱行为随其浓度的增加，主峰的保留时间也随之增大。2.流动相的pH值对聚合物检出的影响：相同浓度，pH不同，样品分离情况也不同，如阿莫西林在pH7.0的0.05M磷酸盐缓冲液分析时无聚合物峰检出，而改用pH8.0的0.05M磷酸盐缓冲液则分离良好。3.流速：调节流速可改变色谱峰的保留时间，已达到最佳分离效果。（二）.有关对照溶液测定的几个注意点试验证明，β-内酰胺类抗生素在特定的条件下，如水，0.01％SDS或0.5％葡萄糖溶液作为流动相B，可缔合成表观分子量极大的缔和物，其色谱行为与高分子杂质一样，都在Kav＝0流出，表现为单一色谱峰，利用这一特点，作为测定方法中新的定量法——自身对照外标法。但由于β-内酰胺类抗生素品种繁多，结构复杂，故在研究制定各品种方法学时，出现以下几个问题：1.有关对照溶液保留时间与蓝色葡聚糖2000峰保留时间不一致的问题。如头孢拉定，可能SephedexG-10对头孢拉定有一定吸附作用引起，可以通过用0.2M氢氧化钠和0.5M氯化钠溶液约350ml冲洗凝胶柱，然后用水冲洗至中性，使凝胶柱活化，改善保留时间不一致情况。1.标准中系统适用性试验项下要求：取对照溶液连续进样5次，其峰面积相对标准偏差应不大于5.0%。经试验证明，青霉素钠，头孢曲松钠，头孢呋辛钠等大部分品种均能符合要求，且五次记录的色谱图峰的重现性好，但阿莫西林连续五次进样，峰高逐渐降低，而峰宽逐渐增加，色谱柱用上述方法处理活化后略有改善，但仍不可能道道五个峰的重叠。以上现象可能与阿莫西林分子结构有关。考虑阿莫西林为青霉素的半合成产物，结构中有与青霉素相似的母核，而其分子量也较接近，而青霉素在水中的缔合物稳定，重现性好故决定用青霉素作为对照品，并加校正因子计算结果。β-内酰胺类个别品种在特定条件下出现不能完全缔合现象。如硫酸头孢噻利，硫酸头孢匹罗。（三）.样品测定的几个注意点1.低聚物对高聚物分离度的影响。1.实验结果的积分处理凝胶色谱结果的特殊性a.色谱峰不能达到基线分离b.色谱峰的对称性较差或拖尾严重上述情况带来数据处理的复杂性，难以调整峰宽、斜率等参数得到合理的积分值。（四）.有关实验技术1.凝胶的预处理要求新使用的凝胶：充分溶胀室温20摄氏度需3小时以上，煮沸需1小时已使用过的凝胶再生：先用0.2MNaOH与0.5MNaCl混合液浸泡半小时后用水洗至中性，装柱。1.装柱要点a.凝胶浆浓度应适合（一般为70％）水混悬液，分散均匀不结团（不宜强烈搅拌）。b.避免空气泡。c.填充时应尽可能使浆液均匀分布，防止分层与气泡产生。1.色谱柱维护保养a.葡聚糖凝胶耐受压力为0.3兆帕，过高压力会损伤填料性能。b.防止柱子长霉可用20％乙醇或0.04％叠氮钠保存。c.防止柱子受污染可用0.2M氢氧化钠和0.5M氯化钠混合液冲洗凝胶柱，然后用水冲洗至中性1.系统适应性试验要求（1）蓝色葡聚糖2000色谱行为的特殊意义a.保留时间表示流动相流速确定条件下的Kav＝0的洗脱时间，即相当于被排阻的聚合物洗脱的保留时间。b.该保留时间与柱效及拖尾因子等参数共同代表色谱柱的性能特征。（2）为什么要对保留时间一致性进行控制保留时间不同的相同样品所得峰面积不同，从而得到不同的结果。五.小结β-内酰胺类抗生素高分子聚合物检查法目前国际药典尚未收载，该项研究工作在国际上也是属于领先，本版药典新增品种较多，在执行过程中可能会遇到某些问题，因此有待于大家提出问题，进一步完善方法。新开发的β-内酰胺抗生素药的高分子聚合物检查方法的研究，也将是我们下一步的研究课题。谢谢！