2012第二章 核酸的分离纯化

第二章核酸的分离纯化Chapter2Extraction&PurificationofNucleicAcid第一节核酸的分离纯化前言•核酸(nucleicacid)是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。•无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。•核酸样品质量将直接关系到实验的成败。EB溴化乙锭I.细胞的破碎II.核蛋白的解聚、变性蛋白的去除III.核酸的沉淀IV.核酸的浓度测定V.核酸的保存分离提取核酸的主要步骤一、核酸分离、纯化原则(一)保持核酸分子一级结构的完整性1意义遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。2分离核酸原则：①温度不要过高；②控制一定的pH值范围(pH值5-9);③保持一定的离子强度;④减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。(二)防止核酸的生物降解•细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。•所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。1.DNA酶抑制剂1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2等。2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。2.RNA酶(RNase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活。常用的RNase抑制剂有：(1)皂土(bentonite),以蒙脱石为主,化学成分(Na,Ca)0.33(Al,Mg,Fe)2[(Si,Al)4O10](OH)2·nH2O,某些阳离子，如Mg、Na、K等，易被其它阳离子交换，故具有较好的离子交换性。作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐,C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：①DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的大100～1000倍。②容易降解，保存在4℃或液氮中；③提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿,37℃2h。④剧毒。其它RNA酶抑制剂(3)肝素Heparin(4)异硫氰酸胍:最有效的RNA酶抑制剂,在裂解组织的同时也使RNA酶失活,既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。(5)RNase阻抑蛋白(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。(6)氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC):由氧化钒离子和核昔形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。二.分离提取核酸的主要步骤(一)细胞的破碎1.高速组织捣碎机捣碎2.玻璃匀浆器匀浆3.超声波处理法4.液氮研磨法5.化学处理法(SDS、吐温80等)6.生化法(溶菌酶、纤维素酶等)(二)核蛋白的解聚、变性蛋白的去除•核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。•分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。常用DNA提取方法：①加入10倍体积的缓冲液：10mMTris-HCl(pH7.4)；150mMNaCl;10mMEDTA;0.5%SDS。•NaCl破坏核酸-蛋白质间的静电引力，使氢键破坏，核蛋白解聚；EDTA敖合Ca2+，使DNase失活；SDS可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离出来。②加入蛋白酶K，蛋白酶K是一种非特异性蛋白酶。它可将蛋白质消化成氨基酸。一般工作浓度是50～100μg/ml。•反应时间5小时，反应温度55°C。•酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。•氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。•在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要充分混匀，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇(酚：氯：异戊醇=25：24：1)。③酚/氯仿抽提使用酚时应注意1.酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。2.酚具有很强的结合水的能力，因此在使用前需要用pH8的10mMTris-HCl饱和后，加入抗氧化剂β-巯基乙醇和8羟基喹啉。3.酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。RNA提取时的注意事项•RNA的提取多采用强变性剂，如异硫氰酸胍等。它不仅可以裂解细胞同时可以有效抑制RNase的活性。•由于RNase无处不在，所以在进行RNA操作时应预防RNase的污染。如带一次性手套、高温烘烤玻璃器皿、DEPC处理液体和塑料制品等。•酚用水饱和。•原理：真核生物的mRNA的特点•方法：1.Oligo(dT)-纤维柱2.磁珠标记的Oligo(dT)mRNA(带Poly(A)的RNA分离提取(三)核酸的沉淀•沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。1.DNA沉淀的盐类及浓度乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。加入盐阳离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。(1)乙醇•优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去。•缺点：需要量大(2～3倍体积)。2有机沉淀剂(2)异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。(3)聚乙二醇(PEG)优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。硅胶吸附DNA(4)精胺(spermine)精胺可快速有效沉淀DNA。原理：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。•聚亚乙基亚胺（简称PEI，或PolyminP）是亚乙基亚胺（Ethyleneimine）的线性聚合物，分子式中的n约为700–2000。其胺基的pKa在11-12之间，在一般中性的溶液中带有大量的正电荷，为阳离子多聚物。•利用聚亚乙基亚胺沉降核酸或蛋白质的原理和使用盐析法有很大的不同，效果也不一样。比如用NH2SO4，是去除蛋白质的水分子层（水化膜），需要，如50%的NH2SO4饱和度。而聚亚乙基亚胺只需要0.2%（w/v）的浓度，直接和酸性蛋白质结合形成絮凝物。因此，聚亚乙基亚胺是在沉淀物中。(4)聚亚乙基亚胺Polyethyleneimine;PEI3.核酸沉淀的温度和时间•若溶液中核酸浓度很高，在盐离子存在的情况下，加入异丙醇等后即可看到DNA的絮状沉淀。•若溶液中核酸浓度很低，则需在－20°C下过夜。•酵母tRNA有助nanogram级的核酸沉淀。•大于10μg/ml的核酸，冰浴10分钟即可有效沉淀。(四)核酸的浓度测定1紫外分光光度法测定核酸的含量•在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA和RNA为40μg/ml；寡核苷酸为35μg/ml。•需要注意的是OD值范围应该在0.1～0.99之间，否则不符合上述线性关系。(五)核酸的保存1.DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃或加1滴氯仿-70℃可保存数年。2.RNA样品溶于：①0.3mol/LNaAc(pH5.2)加入2倍体积的乙醇中，-70℃保存，可保存数年。②在RNA溶液中，加1滴氯仿或0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。P1:Dissolve6.06gTrisbase,3.72gNa2EDTA·2H2Oin800mldistilledwater.AdjustthepHto8.0withHCl.Adjustthevolumeto1literwithdistilledwater.Add100mgRNaseAperliterofP1.P2:Dissolve8.0gNaOHpelletsin950mldistilledwater,50ml20%SDS(w/v)solution.Thefinalvolumeshouldbe1liter.P3:Dissolve294.5gpotassiumacetatein500mldistilledwater.AdjustthepHto5.5withglacialaceticacid(~110ml).Adjustthevolumeto1literwithdistilledwater.碱裂解法提取大肠杆菌质粒第三节核酸分子杂交技术•具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。•杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。•杂交有固一液相杂交和液相杂交。一、核酸分子杂交的基本原理2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。3、变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加4、DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线5、GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3(二)复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。•具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：•DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。2、复性过程①单链分子间碰撞形成局部双链②局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离③局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列④形成完整的双链分子二、影响杂交的因素1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg，浓度过高影响杂交效率2、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃3、离子强度：①低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加②高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度4、甲酰胺：①甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交②如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交5、核酸分子的复杂性：①核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度②Cot与反应体系中核酸复杂性成正比③两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性TheamountofrenaturationismeasuredrelativetoaC0tvalue.TheC0tvalueistheproductofC0(theinitialconcentrationofDNA),t(timeinseconds),andaconstantthatdependsontheconce