2.γ-氨基丁酸(GABA)的分布及测定方法

γ-氨基丁酸（GABA）的分布及测定方法周青生物化工2110805057一、分布：γ-氨基丁酸在动、植物体内都有分布，在动物体内，GABA主要分布于神经组织中，在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，其含量是单胺类含量的1000倍，而在外围器官中含量很少。在植物体内，GABA是细胞自由氨基酸库的重要组分，胞液中有几种构型，可形成类似脯氨酸的环状结构。高等植物组织中GABA含量通常在0.3～32.5μmol／g之间，超过许多蛋白质类氨基酸的含量。在一些与根瘤菌共生固氮植物的根瘤中，GABA以结合态形式存在，苜蓿中结合态形式的GABA高达干重的6.6%[1]。除此之外，GABA还存在于以下植物中，见表一。表一富含GABA植物物料GABA含量谷物类糙米[2]3.8mg/100g胚芽[2]25.4mg/100g处理后米胚芽[3]350～400mg/100g发芽糙米（处理后）[4]40.00mg/100g米糠[5]10.90mg/100g米糠水提取液[6]0.125mg/100ml米糠水提取液酸水解液[6]0.253mg/100ml根茎叶类桑叶[7][8]226.0mg/100g茶鲜叶（CO2气体嫌气处理5h）[9]180.2mg/100g乌龙茶（先萎凋，后嫌气处理）[9]245.9mg/100g红茶（先萎凋，后嫌气处理）[9]176.5mg/100g贵州苦丁茶[10]7.130mg/100g鲜蕨[11]235.2mg/100g天花粉原料栝楼根[12]0.200%川贵栝楼根[12]0.490%王瓜根[12]0.860%长猫瓜根[12]0.240%菠菜[13]414nmol/g土豆[13]166nmol/g红薯[13]137nmol/g山药[13]129nmol/g羽衣甘蓝[13]122nmol/g二、γ-氨基丁酸（GABA）含量的测定方法①薄层色谱：原理：用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测其浓度。方法：展开剂是正丁醇：醋酸：水=4：1：1。分别吸取5μlγ-氨基丁酸标准品溶液和样品洗脱液，点于自制的硅胶薄层板上，以正丁醇：醋酸：水体积比为4：1：1为展开剂展开，取出晾干，用体积分数0.2％茚三酮乙醇溶液显色，105℃烘数分钟，直至获最大斑点，用CamagTLCscanner3扫描仪扫描。扫描条件为：反射式双波长锯齿扫描,扫描波长λS=515nm,参比波长λR=680nm，狭缝50×0.45mm。黄怀生用最小二乘法对标准溶液点样量和色谱峰面积值进行回归分析，其相关系数可达到0.99以上[14]。黄美娥[15]用此方法测得得蕨菜叶、茎中γ-氨基丁酸的质量分数分别为0.319％、0．141％。采用双波长扫描法[16]，可以避免分离度不佳的其他氨基酸的相互干扰；二、双波长扫描可以排除背景干扰使基线平直；三、能提高灵敏度。②纸电泳法：原理：纸上电泳法，以纸为支持剂，使带电的γ-氨基丁酸于纸上在外电场作用下定向移动，从而达到分离目的。方法：取上清液用于点样于滤纸上，以标准GABA溶液做对照，在电压300V、室温条件下电泳60min，电泳缓冲液为吡啶-冰醋酸混合溶液[吡啶：冰醋酸：蒸馏水(体积比)=2：2：121，pH4.7]。电泳完毕后取出电泳纸，水平摆放，室温下自然晾干，再在80℃电烘箱中风干，挥发掉残留吡啶和醋酸。用喷雾法向电泳纸上均匀喷洒显色剂，于电热恒温干燥箱中90℃烘10min，即显出在有氨基酸区域呈紫红斑点的层析图谱。将与GABA标准品位置一致的斑点剪下，加4ml洗脱液(洗脱液由0.1％硫酸铜溶液和75％乙醇溶液按1:19的体积比混合而成)洗脱90min，在520nm波长处比色测定洗脱液的吸光度[17,18]。③纸层析法原理：纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，利用不同物质在固定相中的分配系数不同，而使混合样品达到分离的层析方法。方法：展开剂V(正丁醇)：V(醋酸)：V(水)=4：1：3，茚三酮溶解于展开剂中，质量浓度为0.4g/L，在展开过程中，茚三酮随着展开剂沿滤纸向上移动。点样后的滤纸条在展开剂中展开、风干显色，将与标准品位置一致的斑点剪下，用洗脱液[V(1g／L硫酸铜)：V(体积分数75%乙醇)=2：38]洗脱，520nm处比色测定[19,20]。④比色法：原理：利用苯酚和次氯酸钠与游离氨反应显色。方法：先做GABA标准曲线：取不同浓度的GABA标准液0.4ml，加0.2mol／L(pH9.0)硼酸盐缓冲液0.6mL，摇匀，加5%苯酚溶液2mL，摇匀，加质量分数6%次氯酸钠溶液1mL，摇匀，放人沸水浴加热5min，立即置冰浴中5min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL60％酒精，进行波谱扫描，在最大吸收峰处测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，GABA的含量为横坐标，绘制标准曲线。把处理的样品按以上方法测吸光度，求出样品中GABA的含量。赵大伟[21]用此方法测得大麦籽粒γ-氨基丁酸含量地区顺序为中国美国；类型顺序为裸皮，多棱二棱。冀宪领[22]测得相同叶位桑叶中GABA的含量为早期叶片高于后期叶片,同一时期不同叶位桑叶中GABA的含量随叶龄的增加逐渐降低，桑叶中GABA的含量在一天中以5：30时含量最低，17：00时含量最高。彭光荣[23]用此方法测得糙米发芽γ-氨基丁酸含量从7．24±0．02mg／100g增加到43．51±0．03mg／100g，当采用10mg／L硒处理后，富硒发芽糙米γ-氨基丁酸38．83±0.12mg／100g。史小峰[24]通过此方法测得明传统发酵豆制品中腐乳汤汁和坯所含GABA的量为最高1225.7mg/L和735.2mg/kg,而豆酱中的较低仅为368mg/kg。测定微生物中谷氨酸脱羧酶的活力也可以用此方法，如孙波[25]利用比色法测定L-谷氨酸在谷氨酸脱羧酶催化下生成γ-氨基丁酸含量，实验确定测定γ-氨基丁酸适宜反应条件为酶反应液1．0mL，1．0mol／LNa2CO溶液0.2mL，1.0mL四硼酸钠缓冲液（0.01mol/L,pH9．18),6％苯酚溶液1.0mL，7.5％NaClO溶液5.0mL，沸水浴10min，冰浴5min，60％乙醇溶液2.0mL，并与氨基酸分析仪法测定进行比较，测得结果相对误差5％，表明两种测定方法没有显著性差异。王芳权和许建军也通过此方法测得酶转化中GABA含量[26,27]，此方法快速，常用于米胚芽和谷氨酸脱羧酶转化体系中GABA质量浓度的定量测定。⑤氨基酸分析仪测定原理：利用各种氨基酸的两性离子特性、极性和分子大小等性质的不同，使用阳离子交换树脂进行色谱分析，采用不同pH和离子强度的缓冲溶液依次进行洗脱。氨基酸洗脱的顺序为：酸性氨基酸、中性和芳香族氨基酸，最后是碱性氨基酸；相对分子质量小的氨基酸比相对分子质量大的氨基酸先洗脱下来。被洗脱的氨基酸与茚三酮进行柱后衍生，大多数衍生物呈蓝紫色，在570nm处有最大吸收；脯氨酸，羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，在440nm处有吸收峰，用紫外可见光检测器进行测定[28]。方法：以日立835—30型氨基酸分析仪为例，先按仪器说明配制缓冲溶液及茚三酮溶液，标准GABA溶液用0.02mol／L盐酸配制成不同浓度，测得峰面积，绘制标准曲线。把处理的样品按以上方法测峰面积，求出样品中GABA的含量[29]。钱爱萍[30]等人用此方法对γ-氨基丁酸标准品作精密度和回收率试验，结果表明：峰位置重现性变异系数为0.17，峰面积重现性变异系数为0.23，回收率97．89%～101.2%。说明此方法稳定、快速，准确。张华[31]和何轶[32]通过此方法测得南瓜中GABA含量为2.956%和沙棘果汁GABA含量为13.4mg/100ml。Chen[33]和Komatsuzaki[34]也采用氨基酸分析仪检测发酵牛奶中GABA含量和发芽糙米经过浸泡和厌氧处理后GABA含量，结果显示用乳酸菌发酵的牛奶和发芽糙米处理后GABA含量为80.6mg/100g和24.9mg/100g。还有报导[35，36]可以检测米胚芽、茶叶中GABA含量。⑥毛细管电泳-电化学检测该方法使用比较少。孔令瑶[37]用亚硫酸钠替代硫醇试剂使GABA与OPA反应，生成稳定具有电化学活性的衍生物，然后采用毛细管电泳-电化学检测(CE—ED)法测定发芽黑米胚芽中GABA的含量。他以自制碳圆盘电极为工作电极，以50mmol／L的硼砂-硼酸缓冲液为运行缓冲液，采用电动进样，检测池为阴极电泳槽。⑦高效液相色谱法该方法精密度和灵敏度高，常被用来测定GABA含量，主要有以下几种方法：1.γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛(OPA)衍生原理：γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛(0PA)衍生反应生成稳定的荧光物质，且在λex（最大激发波长）=348nm，λem（最大发射波长）=450nm波长下有很强的发射，可以准确测定其含量。其反应如下：CHOCHO+SH-CH2-CH2-OHNH2-CH2-CH2-CH2-COOH+SH-CH2-CH2-OHCH2-CH2-CH2-COOHH-衍生剂的配制：称取10mgOPA，加0.5ml甲醇溶解后，加入2ml0.4mol／L硼酸盐缓冲液(pH9.4)和30μl2-巯基乙醇，此衍生剂溶液可保持2d。样品衍生：取样品或标准溶液10μl，加入上述溶液100μl，混匀，反应1min后进样。黄怀生采用分离柱ISC--07Na型，流动相：02M柠檬酸钠缓冲液，pH3．25～10.0，pH梯度洗脱测定Gabaron茶中的γ-氨基丁酸[38]。葛菁萍也利用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法定量测定短乳杆菌发酵液中γ-氨基丁酸含量，利用C18色谱柱，以50mmol／L的乙酸钠(pH6.8)-甲醇-四氢呋喃(A相，82：17：1；B相，22：77：1，V/V)为流动相进行梯度洗脱，可以检测到痕量γ-氨基丁酸(2．2mg／100g)[39]。2.γ-氨基丁酸与2,4-二硝基氟苯（FDNB）衍生：样品衍生化及预处理：以1％FDNB的乙腈溶液作为衍生剂，取配制好的标准GABA溶液或待测样品1mL置于10mL棕色量瓶中，加入0.5mol／LNaHCO3(pH=9.0)溶液1mL，再加入1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液1mL，置于60℃水浴中暗处加热1h后取出，冷却，添加pH=7.0的磷酸盐缓冲液至刻度，混匀，过0.45μm滤膜。不用时样品于4℃下避光保存。吕莹果采用C18柱检测植物中谷氨酸脱羧酶活力，流动相：由A、B双组分组成，A为V(CH3CN)：V(H2O)=1：l；B为pH=7.0的磷酸盐缓冲液。流速为1.0mL／min；检测波长：360nm；柱温：35℃；进样量：5μL。洗脱条件如表二。表二梯度洗脱程序表时间（min）流速（mL/min）A%B%011684201100026116843011684结果发现GABA线性范围在0.2～5g／L（r=0．9954)，回收率高，且衍生化产物在一个月内都能保持稳定[40]。孟祥勇采用2，4—二硝基氟苯柱前衍生法测定发芽前后糙米中GABA的含量，结果显示：糙米中的γ-氨基丁酸由5.01mg／100g提高到35.03mg／100g[41]。3.γ-氨基丁酸与异硫氰酸苯酯(PITC)衍生N=C=S+NH2-CH2-CH2-CH2-COOHNH-C=SCH2-CH2-CH2-COOHNH归纳有两种不同的衍生方法：方法一：样品衍生化：精密量取供试品贮备液适量(80～400μl)，置1mL量瓶中，加异硫氰酸苯酯—乙腈溶液(25μl:2mL)200μl，加三乙胺—乙腈溶液(1.4:8.6)稀释至刻度，摇匀，放置1h，转移至试管中，加正己烷1mL，振摇，分取下层液体，滤过，取续滤液作为待测溶液。陈文琼等人用此方法，利用Venusil—AA氨基酸分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，用二元梯度洗脱，流动相A为0.05mol／L醋酸钠溶液(pH=6．5)，流动相B为乙腈-水(80：20)，检测波长为248nm，得到γ-氨基丁酸的检测浓度在2.056～12