色谱法的原理以及定量分析

第七章色谱法Chromatography第七章色谱法7.1色谱分析法简介7.2色谱图及色谱常用术语7.3色谱法的基本理论7.4色谱定性和定量分析7.5气相色谱法7.6高效液相色谱法7.1.1色谱法的产生和发展7.1.2什么是色谱法7.1.3色谱法分类7.1色谱分析法简介1.色谱法的产生色谱法是一种分离技术俄国植物学家茨维特1906年创立7.1.1色谱法的产生和发展分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来一种是被石油醚溶解，使色素向下移动各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。Tsweet的实验2.色谱法的发展1930年代初：R.Kuhn把M.Tswett的方法用于类胡萝卜素的分离，从此色谱法得以广泛应用。1935年：Adams和Holmes第一次用苯酚和甲醛合成了人工有机离子交换剂，能交换阳离子和有机氢离子。后来又合成了阴离子交换剂，既可用于离子交换，又用于色谱分离——即现时流行的离子交换色谱法。至1950年此方法已成型。7.1.1色谱法的产生和发展1938年：Izmailov等人将糊状Al2O3浆液在玻璃板上铺成均匀薄层，用于分离植物中的药用成分，即今日用的薄层色谱。（用于薄层的材料已发展至多种：如硅酸、聚酰胺等）。1941年：Martin和Synge设计了两套萃取仪器，将蛋白质水解产物的乙酰化氨基酸由水溶液中提取到有机相而进行色谱分离。不久又研究了颗粒硅胶柱中三种衍生化氨基酸混合物在水相和有机相(氯仿)之间的不等分配，获得成功，使三个组分得到良好的分离,为液－液分配色谱奠定了基础。1944年：Consden，Gordon和Martin将纤维（滤纸）作固定载体，以水吸附在滤纸上作溶剂，根据组分在两相中溶解度不同，即渗透率（速率）不同而使各组分彼此分离，称之为纸色谱法。1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性载体表面涂渍一层均匀的有机化合物膜作为固定相，并以气体为流动相，用来分离脂肪酸混合物——即今日的气－液色谱。1954年：Ray提出以热导池作为气相色谱的检测器，使气相色谱应用更加广泛。1957年：Golay首先应用小口径毛细管柱进行色谱分离实验，结果证明了它具有高分辨率和高效能——即为今日的高效气相色谱法。1959年：Porath和Flodin提出了使用具有化学惰性的多孔凝胶作固定相的空间排阻色谱法，根据固定相孔隙尺寸不同而具有不同的选择性渗透能力，从而对分子量分布不同的样品实现了分离。可用于测定聚合物的相对分子质量的的分布。我国情况我国在色谱分析领域的研究起于1954年中国科学院大连化学物理研究所首先开发经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色，居世界领先行列。随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。1.色谱法混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。7.1.2什么是色谱法2.色谱法中共使用两相固定相—固定不动的相（如：CaCO3）•固体吸附剂：CaCO3、Al2O3等•液体固定相（载体+固定液——高沸点有机化合物，涂在载体上）流动相—推动混合物流动的相（如：石油醚）•气体•1952年产生GC，是色谱法一项革命性进展•液体•流的速度慢，加压，使其流快，1969年HPLC7.1.2什么是色谱法3.色谱分离法特征一定是先分离、后分析一定具有两相：固定相和流动相分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离7.1.2什么是色谱法4.色谱法特点：（1）分离效能高（2）灵敏度高（3）分析速度快（4）应用范围广7.1.2什么是色谱法1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类7.1.3色谱法分类（1）气相色谱（2）液相色谱（3）超临界液体色谱（1）柱色（2）纸色谱（3）薄层色谱（1）吸附色谱（2）分配色谱（3）离子交换色谱（4）凝胶色谱1、按两相状态分类气相色谱—气体作流动相（1）气固色谱：气体作流动相，固体吸附剂作固定相（2）气液色谱：气体作流动相，固定液作固定相。液相色谱—液体作流动相（1）液固色谱：液体作流动相，固体吸附剂作固体相（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。超临界液体色谱——超临界流体作色谱流动相。7.1.3色谱法分类2、按操作形式分类（1）柱色谱：填充柱色谱—固定相填充到柱管内毛细管柱色谱—把固定相涂在毛细管内壁上，中间是空的。（2）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。7.1.3色谱法分类3、按分离原理分类（1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。（2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。（3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。7.1.3色谱法分类第七章色谱法7.1色谱分析法简介7.2色谱图及色谱常用术语7.3色谱法的基本理论7.4色谱定性和定量分析7.5气相色谱法7.6高效液相色谱法7.2.1色谱图7.2.2色谱常用术语7.2.3根据色谱图可得到的重要信息7.2色谱图及色谱常用术语7.2.1色谱图混合物样品（A+B）→色谱柱中分离→检测器→记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线1.基线在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。稳定情况下是一条直线基线上下波动称为噪音7.2.1色谱常用术语2.色谱峰的高度（峰高，h）色谱峰最高点与基线之间的距离可用mm、mV、mA表示峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好h3.色谱峰的宽度(区域宽度)标准偏差—σ峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。峰底宽Wb—色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离Wb=4σ半峰宽W1/2—峰高一半处色谱峰的宽度W1/2=2.354σWb=4σW1/2=0.589WbWbσW1/24.色谱峰面积（A）色谱峰与峰底所围的面积。对于对称的色谱峰A=1.065hW1/2对于非对称的色谱峰A=1.065h(W0.15+W0.85)/25.死时间t0不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需时间从进样开始到柱后出现峰最大值所需时间气相色谱—惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需时间t06.保留时间tR组分流经色谱柱时所需时间。进样开始到柱后出现最大值时所需的时间操作条件不变时，一种组分有一个tR定值定性参数7.调整保留时间t’R扣除了死时间的保留时间，又称校正保留时间，实际保留时间。t’R=tR-t0体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。t’R8.死体积V0不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。V0=t0F0F0---柱后出口处流动相的体积流速mL/min9.保留体积VR组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积VR=tRF010.调整保留体积V’R扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。V’R=t’RF011.相对保留值γi,s在相同操作条件下，组分i对参比组分s调整保留值之比RsRiRsRisiVVtt.色谱保留值——定性的依据6.保留时间tR7.调整保留时间t’R9.保留体积VR10.调整保留体积V’R11.相对保留值γi,s组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。V0、t0与被测组分无关，因而V’R.t’R更合理地反映了物质在柱中的保留情况。7.2.3根据色谱图可得到的重要信息（1）色谱峰个数—判断样品中所含组分的最少个数（2）色谱峰的位置即保留值—进行定性分析（3）色谱峰的h、A—进行定量分析（4）色谱峰的位置及峰的宽度—可评价色谱柱效（分离效能）（5）色谱峰两峰间的距离—可评价固定相或流动相选择是否合适第七章色谱法7.1色谱分析法简介7.2色谱图及色谱常用术语7.3色谱法的基本理论7.4色谱定性和定量分析7.5气相色谱法7.6高效液相色谱法色谱分析目的是将样品中各组分彼此分离对样品中的组分进行定性、定量分析组分达到完全分离，两峰间的距离须足够远两峰间的距离是由组分由在两相间的分配系数K决定，即与色谱过程的热力学性质有关。两峰间虽有一定距离，但若每个峰都很宽，彼此重叠，则峰不能分开峰的宽或窄是由组分在色谱住中传质和扩散行为决定，即与色谱过程的动力学性质有关7.3色谱法的基本理论7.3.1分配系数和分配比7.3.2塔板理论7.3.3速率理论—范第姆特方程7.3.4分离度7.3.5基本分离方程7.3色谱法的基本理论在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k’来表示。7.3.1分配系数和分配比K仅与两个变量相关：固定相、温度TK与两相体积、管柱特性、使用仪器无关=cs/cm组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度K=1.分配系数K(浓度分配系数)7.3.1分配系数和分配比Cs和cm----组分在固定相和流动相中的浓度2.分配比k(容量因子，容量比)组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量=KVs/Vmk==ms/mmk随T、固定相、流动相的体积变化而变化k越大，组分在固定相中质量越多，tR越长K、k越大，组分在固定相中tR就越长7.3.1分配系数和分配比ms和mm----组分在固定相和流动相中的质量Vs和Vm----柱中固定相和流动相中的体积3.k与tR之间的关系k=t’R/t0=(tR-t0)/t0k=V’R/V0=(VR-V0)/V07.3.1分配系数和分配比4.K及k与选择因子α之间的关系7.3.1分配系数和分配比实际意义：α=1→K（B）=K（A）,t’R(B)=t’R(A)→A、B两组分色谱峰重合→K或k相差越大，分离越好，→色谱分离先决条件：两组分具有不同的K或kα≠1（α1或α1）)()(''AtBtRR)()()()(AKBKAkBk在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论－塔板理论用于色谱分析法用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为入埋论塔板数作为衡量柱效率的指标7.3.2塔板理论塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。1.基本假设7.3.2塔板理论n=L/H或H=L/nL---色谱柱长度H---塔板高度n---塔板数目L固定，H越小，n越多，分离效果越好，H、n评价柱效n与Wb，W1/2的关系n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)22.塔板理论方程式7.3.2塔板理论有时计算的n大且H小，但分离效果却不好原因：tR内含t0后来改用有效塔板数和有效塔板高度n有效=5.54(t’R/W1/2)2=16(t’R/Wb)2H有效＝Ｌ／n有效n理=5.54(tR/W1/2)2=