利用GUS基因表达观察启动子功能b

利用GUS基因表达观察启动子功能一、实验目的1.了解报告基因及其应用；2.学习启动子功能研究的方法。二、实验原理1.启动子（Promoter）•启动子是位于基因5‘端近旁的一段调控序列，能作为RNA聚合酶的结合位点，同时也是转录因子结合的位点。•分子生物学上,把启动子称作顺式调控元件,把转录因子称作反式作用因子。在真核生物中，通过顺式调控元件和反式作用因子的相互作用，对基因表达进行调控。•启动子的功能可以通过报告基因进行方便的检测。Thepromoterregioninhighereukaryotes.TheTATAboxislocatedapproximately30basepairsfromthemRNAstartsite.Usually,twoormorepromoter-proximalelementsarefound100and200bpupstreamofthemRNAstartsite.TheCCAATboxandtheGC-richboxareshownhere.OtherupstreamelementsincludethesequencesGCCACACCCandATGCAAAT.Thecorepromoter,promoter-proximalelements,anddistance-independentelementsareallDNAsitesthatarerecognizedbysequence-specificDNA-bindingproteins.Theproperconstellationofsuchtrans-actingproteinsisrequiredforRNApolymeraseIItoinitiatetranscriptionandtoachievemaximalratesoftranscription.Themolecularapparatuscontrollingtranscriptioninhumancells是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而筛选得到转化体，并利用它的表达产物来研究目的基因的表达调控。主要用于：转化子的鉴定基因表达调控的研究：基因表达的组织特异性；不同发育阶段基因表达的特点；内外环境因子对基因表达的影响等。2.报告基因（reportergene）报告基因一般具备以下特点：（1）报告基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；（2）受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。•选择何种报告基因系统是根据研究的目的、组织与细胞的类别、信号检测的时间性与空间性，以及首选的检测方法而定。•目前，报告基因技术已被广泛应用到高产量药物的筛选、基因治疗实验、以及生物传感器的构建以及基因的调控与功能的研究中。常用的报告基因•β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）•氯霉素转乙酰酶基因（cat）•新霉素磷酸转移酶基因（npt-II)•绿色荧光蛋白基因（gfp）•冠瘿碱合成酶基因•β-半乳糖苷酶基因3.β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因•GUS由uidA编码，其产物是葡萄糖苷酶（β-glucuronidase)，该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。•广泛用于转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在研究外源基因瞬时表达的转化实验中。GUS检测方法：•组织化学染色定位法(定性)能够将无色的底物x-gluc催化生成蓝色的产物。•荧光法（定量）以4-甲基伞形酮酰－β－D葡萄糖醛酸苷为底物，GUS催化其水解为4－甲基伞形酮及β－D葡萄糖醛酸。4－甲基伞形酮分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。4.吲哚乙酸（IAA）•吲哚乙酸（IAA）是最早发现的激素（auxin），这是一种生长素，它是研究最多的一种激素。吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。5.本实验原理1）将IAA2promoter与GUS相连后导入拟南芥。转基因植物进行GUS染色，观察到的GUS表达位点。gusIAA2promoterNos-terIAAmRNA2）观察GUS表达的组织特异性：观察不同组织（根，叶等）GUS活性的强弱。出现蓝色的地方即就是IAA2启动子工作的地方。3）影响基因表达的因素：影响GUS表达的因素就是影响IAA2启动子功能的因素。如：外源生长素处理。实验中,我们将在根冠和原韧皮部看到蓝色，因此生长素是影响这个启动子工作的因子之一。其它基因的影响：可以将IAA2promoter-GUS的转基因植物和一些突变体杂交,研究在某些基因突变的条件下,IAA2的工作状态发生了什么变化.下图中,斜体小写aux1表示生长素不会内流的突变体。也可以将IAA2启动子切割成不同的片段,再连上报告基因,研究哪些部分失去以后就永远观察不到或在某些条件下观察不到蓝色了,这些部分就是启动子中的关键部分.就本启动子而言,auxinresponseelement(AuRE)(生长素反应元件)5‘-TGTCTC-3’是一个很重要的区域。Figure1.AnalysisofIAAaccumulationinwild-typeandaux1Arabidopsisrootapices.(A)HighresolutionIAAquantitationinArabidopsiswild-type()andaux1()rootsegments.(B)DICimageofwhole-mountGUS-stainedwild-typeIAA2::uidArootapex.(C)DICimageofwhole-mountGUS-stainedaux1IAA2::uidArootapex.(D)RadialsectionofGUS-stainedwild-typeIAA2::uidArootapex.Scalebars,50µm.实验步骤•育苗：拟南芥(IAA2::uidA）种子经表面消毒后接种于无菌的B5琼脂培养基。•生长素处理：将拟南芥小苗转接至含有生长素（0.1MIAA)的新鲜培养基中处理1天。•GUS染色：染色0.5－1.5h，叶子部分需80％酒精中脱色30min后观察。•镜检：观察GUS表达的组织特异性，IAA对GUS表达的影响。GUS染液的配制母液♦20mMX-glucindimethyformamide♦0.2mMNa2HPO4♦0.2mMNaH2PO4♦100mMEDTA♦10mM高铁氰化钾♦1％Triton-X100最终反应液（100ul）0.2mMNa2HPO430.5ul0.2mMNaH2PO419.5ul100mMEDTA10ul10mM高铁氰化钾10ul1％Triton-X10010ulX-gluc母液5ulddH2O15ulStele：中柱；endodermis；内皮；cortex：皮层；columella：小柱；lateralrootcap：根冠；epidermis：表皮；quiescentcenter：静止中心附录：其它报告基因简介绿色荧光蛋白基因(gfp)绿色荧光蛋白（green-fluorescentprotein,gfp)是一种腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，能在一定波长的紫外线激发下发出绿色荧光。优点：1.适用于各种生物的基因转化；2.检测方法简便，无需底物、酶、辅因子等物质；3.便于活体检测，十分利于活体内基因表达调控的研究。•Laserablation（激光切除）ofthequiescentcenter（静止中心）inthepost-embryonicroot（后胚根）.Confocalscanningimages(共聚焦扫描成像)fromthesameroot.NPTII•新霉素磷酸转移酶（NeomycinPhosphotransferaseII，NPTII）基因是迄今植物遗传转化中应用最为广泛的选择标记。•该基因编码新霉素磷酸转移酶亦称氨基糖苷-3′-磷酸转移酶（aminoglycoside-3′-phosphotransferaseII），其编码产物可使氨基糖苷类抗生素（aminoglycosideangibiotics）如卡那霉素（kanamycin,Km）、新霉素（neomycin）、G418等磷酸化而失活。•卡那霉素等氨基糖苷类抗生素能与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S小亚基相结合，影响70S起始复合物的形成，干扰叶绿体及线粒体的蛋白质合成，从而导致植物细胞死亡。•NPTII通过使ATP分子上的γ-磷酸基转移到卡那霉素等氨基糖苷类抗生素分子上，影响抗生素与核糖体亚基的结合，从而使抗生素失活。附录：模式植物：拟南芥介绍拟南芥Arabidopsisthaliana拟南芥作为高等植物研究的模式植物的理由•生命周期短，仅有一个月；•这种杂草状的十字花科植物，在所有植物中基因组率先被完整破译.•拟南芥只有五对染色体，基因组较小。•转基因操作方便。•1999年12月14日美英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。这使拟南芥研究进入到功能基因组学研究，大大加速了功能基因的定位。