色谱原理及应用

11化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱分析原理及应用主讲人：郭宾湖南师范大学2013-11-1322化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室★高效分离：复杂混合物中组分分离技术★兼容性强：联用各鉴定方法实现技术集成★应用最广：分析化学仪器/方法色谱分析法的特殊地位【当代前沿科学领域：生命、材料、环境/能源、信息】【过滤、蒸馏、重结晶、溶剂萃取、化学/电解沉淀】33化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室资料来源：GlobalIndustryAnalyst,Inc.HPLCSystems&Accessories.2008HPLC系统用户结构HPLC仪器产品市场高效液相色谱（HPLC）：目前使用最普遍环境检测农业&食品有机化学业生物&制药其它独立检测政府单位学术机构44化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室分析效率高：可把组分复杂的样品快速分离成单组分检测灵敏度高：可作超纯气体、高分子单体的痕迹量杂质分析和空气中微量毒物的分析样品用量少：一般气体样用几毫升，液体样用几微升或几十微升选择性好：可有效地分离性质极为相近的各种同分异构体和各种同位素易于自动化。色谱法的特点55化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室分析化学的特点和趋势•①样品复杂：大气、水体、土壤、矿渣、生物等；•②对象多样：无机物、有机物、动态、亚稳态•③痕量、超痕量分析：μg~pg•④表面、微区、结构、形态、动态迁移、时空分布•⑤原位、在线、多参量、多技术集成•⑥自动化、微型（便携）化、智能化66化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室★技术整合：多维分离、检测器联用★新型分离材料：色谱柱固定相★新型分离原理：超临界流体、毛细管电泳★前处理技术：在线富集、直接进样★微流控芯片：多功能化、微型化、集约化色谱技术发展新动向77化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱在分析化学中的应用分析方法学（特殊矛盾）三要素：色谱方法理论技术研究对象（科学问题）药物环境生物医学材料88化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室目录色谱学基本原理一气相色谱方法及应用二液相色谱方法及应用三99化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱学基本原理第一部分一、色谱法的起源和发展二、色谱过程和有关概念三、色谱法基本理论四、分离效能及影响因素10ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited原理：组分“赛跑”什么是色谱？核心问题——复杂体系的分离11ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited分离原理——组分“赛跑”“起跑”：进样“跑道”：过柱“冲刺”：检测（“障碍”、“长跑”、“游泳”……：分离模式）1212化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室1903年，Tswett（俄国植物学家），用碳酸钙分离植物色素时出现色带，“色谱法”因之得名。色谱分离现象的发现色带“chromatograph”碳酸钙颗粒玻璃管石油醚→固定相→色谱柱→流动相流出液一、色谱法起源及其发展1313化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱法概念的扩展定义：以试样组分在固定相和流动相间的吸附、分配、扩散、亲和、静电力或其他作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法统称色谱法或层析法。•基本要素：流动相、固定相及其使用形式•分离机制：吸附、分配（溶解）、扩散（渗透）、生物亲和、静电作用、电渗等物理化学原理•分析对象：不局限于有色物质(取决于检测器)1414化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室色谱法的分类•按流动相物理状态•按固定相使用形式柱色谱、毛细管色谱、平板色谱（纸色谱、薄层色谱）•按分离原理吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶（体积排阻）色谱、亲和色谱、毛细管电泳等•按展开程序洗脱法、顶替法、迎头法气相色谱（GC）：气-固色谱、气-液色谱液相色谱（LC）：液-固色谱、液-液色谱超临界流体色谱（SFC）1515化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室经典色谱法发展历程1906年，Tswett发现色谱现象（液-固吸附色谱）1941年，英国Martin和Synge开创液-液分配色谱、创立气-液色谱、建立色谱塔板理论（1952年诺贝尔化学奖）1956年，荷兰VanDeemter提出速率理论方程1957年，美国Golay提出毛细管柱气相色谱1969年，首台高效液相色谱仪问世，开启HPLC快速发展时代1980~，毛细管电色谱1990~，光色谱1616化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室二、色谱过程和基本概念试样峰A峰B流动相信号检测器色谱柱（含固定相）（一）色谱过程及工作原理（以分配色谱为例）•色谱过程是组分在两相间多次“分配”的动态平衡；•组分结构差异→分配系数差异→与固定相作用差异→流动相洗脱差异→差速流出→色谱分离洗脱时间1717化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室（二）色谱流出曲线及有关术语1.基线、峰高和峰面积【定量参数】色谱图是以组分的浓度变化作为纵坐标，流出时间作为横坐标的。这种曲线称为色谱流出曲线。基线：色谱柱仅流动相通过时检测器信号随时间的变化。峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离（h）。峰面积：色谱峰曲线下与基线间所覆盖的面积（A）。基线色谱峰峰高（h）1818化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室噪音(noise)：基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。噪音漂移漂移(shift)：基线随时间定向缓慢变化。如程序升温时，柱固定相流失增加造成基线上漂。1919化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室（二）色谱流出曲线及有关术语2.色谱保留值【定性参数】进样峰1峰2流动相峰保留时间（tR）：从进样开始到组分出现峰极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间。死时间（t0）：不被固定相溶解或吸附的组分从进样至峰极大值所需时间；即分配系数为零的组分的保留时间。调整保留时间（tR’）：tR’=tR-t0，扣除死时间的保留时间，即实际反映组分在柱固定相中的滞留时间。2020化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室（二）色谱流出曲线及有关术语2.色谱保留值【定性参数】死体积（V0）：V0=t0·F0。保留体积（VR）：VR=tR·F0。调整保留体积（VR’）：VR’=tR’·F0或VR’=VR–V0。保留体积（V）：将时间参数转化为体积，不受流动相流速（F0）的影响。相对保留值（或）：将绝对值校正为相对值，不受流动相、色谱柱形状的影响，而只与柱温和固定相性质有关。相对保留值（2,1）或固定相选择性系数（）：两组份的调整保留值之比，1212kkKK=='1'2'1'212VVttrRRRR===，2121化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室（二）色谱流出曲线及有关术语3.色谱峰区域宽度【柱效参数】标准偏差（）：0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。决定峰的扩散度。半峰宽（W1/2）：峰高一半处的峰宽，W1/2=2.35。峰宽（W）：峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离，W=4=1.7W1/2。拐点拐点2222化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室正常峰（对称）：不良峰ABAAWfhs2/)(2/05.0==4.色谱峰对称因子（fs）ABAAWfhs2)(205.0==（二）色谱流出曲线及有关术语fs=0.95~1.05fs0.95fs1.05前延峰：拖尾峰：2323化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室三、色谱法基本理论（一）理论基础：线性分配色谱1.分配系数（K）指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比，K=Cs/Cm。K为相平衡热力学常数。一定条件下仅与组分性质有关。当柱中溶质浓度较低时，K可以认为是常数（线性色谱过程）。K大的组份洗脱时间长，K小的组份所需时间短。组分间只要K不同，就可实现分离。典型的分配等温线CsCm2424化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室2.容量因子或分配比或质量分配系数（ｋ）（一）理论基础：线性分配色谱指在一定温度和压力下，组分在达分配平衡时，在固定相与流动相中的质量比（决定组分最终分离）。msVVK=mmssmsVCVCmmk==K=柱内固定相空隙体积Vm相比=柱固定相体积Vs填充柱β约6-35；毛细管柱β为50-10002525化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室3.分配系数、容量因子与保留时间的关系（一）理论基础：线性分配色谱滞留因子（Rs）：Rs=组分在色谱柱中迁移速度流动相的线速度usu=（Rs≤1）由于有：tR=t0(1+k)k=tR’/t02626化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室4.分配系数、容量因子与色谱分离（一）理论基础：线性分配色谱tR=t0(1+k)=t0(1+K/)K=0，组分不保留K↑，tR↑，组分后出柱K→∞，组分完全保留KA≠KB或kA≠kB是色谱分离的前提。)1(0ARKA/tt=)1(0BBRK/tt=0DRBAtKK2727化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室1.塔板模型与基本假设（二）热力学理论：塔板理论(Platetheory)一个半经验理论(1952)将色谱分离过程比作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。经多次分配平衡，分配系数小的组分，先离塔，分配系数大的组分后离塔2828化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室模型基本假设：•①在色谱柱内每一“塔板”H内，组分在两相间瞬间达到分配平衡;•②流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积;•③分配系数在各塔板内是常数;•④纵向扩散可以忽略（二）热力学理论：塔板理论(PlateTheory)2929化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室2.质量分配与转移规律经过N次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式：转移N次后，第r号塔板中的质量Nmr：色谱柱n=103以上，组分有微小的分配系数(容量因子)差别即可实现完全分离。（二）热力学理论：塔板理论(PlateTheory)3030化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室2.质量分配与转移规律组分A(kA=1)在n=5的色谱柱内和出口的分布Nr01234柱出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.2500.3750.2500.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1650.2740.2740.11880.0040.0320.1110.2200.2740.13790.0020.0180.0720.1660.2470.137100.0010.0100.0450.0940.2070.1243131化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室2.质量分配与转移规律组分B(kB=0.5)在n=5的色谱柱内及出口的分布Nr01234柱出口010000010.3330.667000020.1110.4440.44500030.0370.2220.4440.2960040.0120.0990.2690.3950.198050.0040.0410.1640.3290.3290.13260.0010.0160.0820.2190.3290.219700.0060.0380.1280.2560.219800.0020.0170.0680.1700.1