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实验报告课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：方祥年成绩：__________________实验名称：离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。二、实验内容和原理（1）实验原理1、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。基质电荷基团反离子电荷基团反离子电荷基团反离子基质基质—＋—＋＋可逆交换可逆交换＋＋溶液中的离子或离子化合物（交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖)———阳离子交换剂阴离子交换剂专业：农业资源与环境姓名：李佳怡学号：3130100246日期：2015.5.19地点：生物实验中心310装订线由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。本实验采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热（100℃）被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。（2）实验内容1、离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品Ⅲ；2、定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。三、实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ2、实验试剂①DEAE-SepharoseFastFlow(弱碱性阴离子交换剂)；②20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液；③20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3缓冲液；④0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；⑤5%蔗糖溶液；⑥3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）。附：3，5-二硝基水杨酸试剂配置方法甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠；乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。四、实验器材与仪器1、高速冷冻离心机；2、层析柱（φ1.0×20㎝）；3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)；4、梯度混合器(100ml梯度杯)；5、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）；6、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）；7、部分收集器及收集试管（4ml/管）；8、铁架台、夹子（固定层析柱用）；9、－20℃冰箱（保存样品用）；10、微量移液枪200ul、1000ul；11、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）；12、7ml离心管（留样品Ⅳ用）；13、恒温水浴（100℃）；14、试管、移液管、试管架等。五、操作方法和实验步骤1、样品处理（实验1已经完成）①取其中体积较多一只离心管中保存溶液用作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶；②剩余一只用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS-PAGE分析。③本实验中取离心管中较多的一只离心管用于实验。2、装柱、平衡：①检漏：在层析柱中装入水，观察其有无渗漏，如有渗漏，需进行更换；②连接纯化检测系统：按照示意图将系统连接；（梯度混合器在之后打开）③调流速：装柱前先调好流速0.8ml～1ml/min；④加固定相（离子交换剂）：a将柱下端的出水口关闭；b加进5ml（约1/3柱床体积）20mmol/LTris-HClpH7.3的缓冲液；c将处理好的DEAE—SepharoseFastFlow，轻轻搅匀沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。注意事项：a凝胶不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态；b加入过程不能带进气泡。⑤调整、平衡：待凝胶自然沉积离柱管上端约1-3cm后松开层析柱出口，控制流速0.8ml～1ml/min；待柱内凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（注意保持凝胶柱面平整）。用20mmol/LTris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。3、加样：①关闭恒流泵：停止加入20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。②加样品：用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。注意事项：a加样过程中要缓慢，防止凝胶扬起；b在操作的过程中可以采取虎口加样的方法③进行洗脱：打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。4、洗脱（梯度洗脱法）①平衡：加样后，用20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白；②梯度洗脱：待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出基线稳定，用20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/LNaCl）层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液和50ml含1mol/LNaCl的0.05ml/LTris-HClpH7.3缓冲液。洗脱流速为0.8～1ml/min，每4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。5、酶活力检测①检测：跟踪测定峰值及两侧对应试管的蔗糖酶活力(用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖，从而测定酶活力）蔗糖酶活力检测空白对照样品管0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.550μL50μL5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml分离纯化样品溶液/0.1ml50℃水浴5min3.5－二硝基水杨酸试剂0.5ml0.5ml100℃水浴5min蒸馏水5ml5ml②留样：将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定、SDS-PAGE分析、酶的基本性质实验和用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品低温－20℃保存。六、实验数据记录和处理样品离心后：上层淡黄色，下层乳黄色。柱层析图：七、实验结果与分析活力测定结果：根据水浴后各个试管内的颜色深浅判断，第11、12管颜色最深，判断其酶活力最高，与图谱波峰状况相吻合。图谱分析：洗脱共有两个峰，第一个峰较高，为杂质峰，第二个峰才为洗脱峰。但洗脱凤峰形并不好，没有明显的下降坡，峰拖的很长。判断原因可能为：在加入蔗糖酶蛋白样品溶液时，由于样品量过多，分两次加入，前后两次之间有一定的时间差，导致洗脱峰出现后，下降缓慢，甚至有微微上升的趋势。并且，杂质峰也有下降后重新上升的峰，由此推断洗脱峰峰形不好的原因为加入样品时的不当操作。同时杂质峰很高，并且持续时间较长，表明杂质很多。小结：蔗糖酶含量高而且活性强的时候，能在短时间内将大量的蔗糖水解成还原性糖，而3.5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热（100℃）被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，可依此检验还原糖的量从而标定蔗糖酶的活力及含量。据实验结果检验可知第一个峰为杂质蛋白，第二个峰为蔗糖酶蛋白。实验收集的11、12管颜色最深，收集该两管酶液。八、讨论、心得1、此次实验涉及了很多仪器的使用，由此也总结了一些使用要点和此类实验中的一些注意事项：①在进行凝胶的装填时需要一段时间等待沉降且在整个装填过程中决不能使凝胶暴露在空气里，一旦暴露，那么需要重新装填。且要求填装得均匀，整齐，没有气泡。本次试验我们小组就因为干胶而导致了实验的失败。不仅浪费了很多时间，也表明我们的实验能力还有待提高。②在使用浓度梯度时需要注意首先应该排出其中的气泡，用胶头滴管分别对准气孔吹吸已达到出去气泡的目的。气泡的存在会影响盐溶液的浓度，从而影响实验的进行。③在使用移液枪时应当注意不同的液体应当换取枪头，以免引起液体的污染。④试管收集器有些时候不够灵敏，应当注意手动调节。⑤在检测蔗糖酶时由于可以大致推测出现的试管号，在检测时可以有针对性的进行选取，比如可以按照1,3,5,6,7，8等这样的顺序检验。⑥分离柱的螺帽在使用前应该清洗干净，防止堵塞。同时应该检查长细管是否流畅，以保证实验的顺利进行。⑦在进行实验前需检查分离柱是否是垂直的。⑧打开浓度梯度仪时，当有气泡进入柱时，要求凝胶上方有液体则保证了实验的安全性。⑨由于该实验较为耗费时间，三个人应该明确分工，有条不紊，这样才可以做到高效。2、理论深化：①防凝胶干的目的：防气泡，使柱床压紧，减少死体积，从而避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层的问题，有利于分辨率的提高。②柱平衡的原因：离子层析法使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。柱子装好后用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。③为什么要洗脱加样？——层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用凝胶过滤达此目的。④梯度洗脱优点：提高柱效，改善检测器的灵敏度⑤梯度洗脱原理：当样品中的一个峰的k值和最后一个峰的k值相差几十倍至几百倍时，使用梯度洗脱效果特别好。梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。如图（两个图一种原理，前者为洗脱装置和柱子之间封闭，适用于配备压力泵的色谱柱，后者为洗脱装置和柱子之间隔离开来，是梯度洗脱的简易装置。）两个容器放于同一水平上，两容器连通，B与柱相连，当溶液由B流入柱时，A中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。3、实验体会这次试验整体感觉是混乱，主要原因是对实验过程和仪器操作的不熟悉以及思路的不清晰。虽然课件上已经把实验讲述的十分清楚，但是我们小组三人在操作过程中对实验的注意事项不了解，导致了干胶之类的事情发生，应该在每一个环节前理解每个操作的意义，关注注意事项，防止实验失误。所以，如果预习的时候更加仔细一些，对实验过程中可能出现的问题有一定的预想，做好准备措施。另外对实验结果如有一定的了解，这样实验做起来也会更加有方向性和目的性。