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486中国科学C辑生命科学2006,36(6):486~492SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展*唐文洁①②李玛琳①洪岸②**(①昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室,昆明650031;②暨南大学生物工程研究所,广州510632)摘要间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种,广泛存在于人体的间充质组织中,具有自我复制能力和多项分化潜能.单独或联合使用某些细胞因子、生长因子、激素、维生素、抗氧化剂和抗肿瘤药物等,可诱导MSCs在体外培养条件下向某一谱系细胞分化.鉴于MSCs的上述特点,使其有着非常诱人的临床应用前景,可以用于许多种疾病的治疗.本文从MSCs的生物学特性、MSCs的分化诱导、分化调节机制及应用前景等方面进行了评述.关键词间充质干细胞分化诱导调节机制应用收稿日期:2006-05-11;接受日期:2006-07-07*国家重点基础研究发展规划(973计划)(批准号:2001CB510106)资助项目**联系人,E-mail:ojds@jnu.edu.cn间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一种多潜能成体干细胞,在人体发生、发育过程中存在于许多种组织中.20世纪70年代中期,Frieden-stein等人[1]从骨髓中获得了少数能贴壁生长的细胞,这些细胞能分化为成骨或软骨样的沉着物,该发现被认为首次证实了MSCs的存在.目前,已经从成人的多种间充质组织中分离得到MSCs,这些细胞在体外可以扩增并且可以分化为骨、软骨、骨髓基质、肌腱、韧带、脂肪等多种结缔组织细胞,以及骨骼肌细胞、神经细胞和神经胶质细胞等等[2~4].而且,不论是自体的还是同种异源的MSCs一般都不会引起宿主的免疫反应[4].因此,MSCs可以作为组织工程的种子细胞,用于组织构建以治疗一些机体无法自然修复的组织细胞损伤,有着良好的临床应用前景.1间充质干细胞的生物学特性MSCs具有干细胞的一般生物学特点:具有自我复制能力和多项分化潜能;属非终末分化细胞,终生保持未分化或低分化特征,缺乏分化标记;分化情况受所处微环境(干细胞壁龛)的影响;通过对称性和非对称性分裂两种方式生长;具有分裂的慢周期性,绝大多数干细胞处于G0期等[5].MSCs在体外增殖过程中,能形成成纤维细胞样集落形成单位(CFU-F),一般可扩增10~15代.随着代次的增加,传代间隔逐渐延长,细胞增殖速度逐渐降低.约10代以后,细胞出现衰老症状:细胞逐渐停止分裂、由纺锤体形变得宽大扁平,培养液中的细胞碎片和纤维逐渐增加.随着细胞群体倍增次数的增加,CFU-F的数目和大小逐渐降低,直至消失,CFU-F内的细胞形态逐渐宽大扁平,第6期唐文洁等:间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展487细胞汇合程度逐渐降低.利用免疫沉淀印迹技术、荧光激活的细胞分选术(FACS)、免疫磁珠分选技术等已鉴定了许多MSCs的表面抗原.STRO-1是昀早被发现的、非特异性识别骨髓单个核细胞表面抗原分子的抗体分子之一,可富集人骨髓中能形成CFU-F的细胞.STRO-1联合使用血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)/CD106的抗体可以筛选出STRO-1+VCAM-1+的亚细胞群,这些细胞形成CFU-F的几率接近50%.多潜能的MSCs就存在于STRO-1+细胞群中.SH2抗体可以识别MSCs表面的转化生长因子β(TGFβ)受体Ⅲ,也即CD105;SH3和SH4抗体识别CD73;SB10抗体识别活化的白细胞黏附分子(ALCAM)/CD166[4,6].实验显示,人MSCs除了表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1),ICAM-2,VCAM-1,CD72,白细胞功能相关抗原-3(LFA-3)外,还表达整合素α1(CD49a),α2(CD49b),α3(CD49c),α5(CD49e),α6(CD49f),αV,β1,β3和β4(CD104),低度表达CD44,而不表达CD34,CD45,CD117(cKit),Ⅰ型HLA和HLA-DR[2,7].但是,上述MSCs阳性的表面抗原也表达于其它细胞表面,因此,阻碍了对体内MSCs的增殖、动员和归巢的研究工作,亟需发现一个特异性的人MSCs表面标记.研究者一般联合应用多种抗体分子来鉴别人MSCs,如STRO-1,SH2,SH3,SH4等,同时MSCs缺少造血细胞的特异性标志,如CD45,CD34和CD14.干细胞分离纯化的方法有多种,包括:(ⅰ)利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法;(ⅱ)选择性的细胞凝聚;(ⅲ)基于不同黏附特性的细胞分离方法;(ⅳ)利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法等[5].以骨髓MSCs的分离纯化为例,骨髓细胞经Percoll(1.073g/mL)或Ficoll-Paque(1.077g/mL)密度梯度离心获得单个核细胞后,再用FACS或免疫磁珠分选技术去除CD45+和血型糖蛋白-A+(GlyA+)细胞,可使MSCs得到进一步纯化.即使经多级分离步骤得到的原代培养物中,除了呈成纤维细胞样的MSCs外,还混杂有一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等.对于红细胞,因其不贴壁,可通过换液除去.对于贴壁细胞,可根据其黏附能力的不同,通过控制胰蛋白酶-EDTA的消化时间,保证MSCs在短时间内与培养瓶底分离,而巨噬细胞、单核细胞等仍然贴附.随着传代次数的增加,MSCs逐步得到纯化.除了骨髓,也可从脂肪、脐血、胎盘组织中分离得到MSCs[8~11],与骨髓来源者比较,它们具有相似的细胞形态、表面抗原、基因表达和增殖、分化能力,因取材方便,这些组织有望代替骨髓成为成体干细胞的来源.另外,研究者还分别从胎儿、成人、老年人的皮肤和骨骼肌的结缔组织中、脐静脉内皮下层、成人膝关节滑膜等处分离出多潜能性的MSCs[12,13].关于MSCs的分化潜能:一则,体外实验显示在特定培养条件下,MSCs可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞;内胚层起源的肝细胞、胰岛β细胞;外胚层起源的视网膜细胞、神经细胞和神经胶质细胞等.二则,动物实验和临床实验表明,将全骨髓或初步纯化的骨髓MSCs移植入损伤或转基因动物以及病人体内,骨髓干细胞可以迁移并分化为骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胆管细胞、表皮细胞、消化管细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞、胰岛β细胞、肾细胞、神经细胞和神经胶质细胞等[14].2间充质干细胞的分化诱导2.1向成骨细胞的分化诱导在生长培养液中添加一定浓度范围的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸可以使人骨髓MSCs分化为成骨细胞[15],表现为碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和骨钙蛋白等基因表达增强,以及细胞外基质钙盐沉积、骨结节形成.单独使用骨形态形成蛋白7(BMP-7)即可诱导人骨髓MSCs分化为成骨细胞[16].甲状旁腺激素(PTH)和1,25-二羟维生素D3在人骨髓MSCs分化过程中,能使骨钙蛋白和碱性磷酸酶基因处于高表达状态,BMP-6可以增强它们的作用,BMP-6和BMP-4还可加强PTH和维生素D3引起的钙盐沉积[17].2.2向软骨细胞的分化诱导首先将人骨髓MSCs离心使其成为细胞团,然后在无血清培养液中添加转化生长因子β3(TGFβ3)[17]或者再添加BMP-6,地塞米松和抗坏血酸等[18]可使488中国科学C辑生命科学第36卷SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences细胞具有软骨细胞的特征:细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖增加.成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)可以增强人骨髓MSCs的增殖能力和软骨分化潜能[19].TGFβ还可使大鼠骨髓MSCs分化为髓核或椎间盘软骨细胞[20].在TGFβ3和地塞米松的基础上再分别添加BMP-2,BMP-4或BMP-6,均可增加人骨髓MSCs向软骨细胞分化,其中以BMP-2作用昀强[21].联合TGFβ3和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)也具有非常强烈的软骨形成诱导作用[22].2.3向肌细胞的分化诱导人骨髓MSCs在含有2%FBS,表皮生长因子(EGF),血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)和5-氮胞苷的培养液中培养一段时间后,可检测到MYO-D和myogenin转录因子[2].5-氮胞苷还可使人骨髓MSCs在体外分化为心肌细胞,合成心肌细胞特征性蛋白如β肌球蛋白重链、结蛋白、α-心肌肌动蛋白和心脏肌钙蛋白T等[23].2.4向神经细胞和神经胶质细胞的分化诱导在生长培养液中加入β-巯基乙醇可以使人骨髓MSCs分化为神经元[24],有神经元特异性烯醇化酶和神经丝-M和tau等基因表达,第一次证实了MSCs在体外可分化为神经元.异丁基甲基黄嘌呤和双丁酰环磷腺苷也可以促进人骨髓MSCs体外分化为神经细胞,各种神经营养因子如脑源性神经营养因子(BDNF),EGF,FGF-2等也具有这种作用[25].EGF联合FGF-2还可使人骨髓MSCs体外分化为Schwann细胞[26].2.5向脂肪细胞的分化诱导在生长培养液中加入异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松或氢化可的松、吲哚美辛以及胰岛素可使人骨髓MSCs在体外分化为脂肪细胞[15,18].分化过程中,细胞表现为脂肪空泡累积,过氧化物酶增殖激活受体γ(PPARγ)、脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白等基因表达增加.2.6向其它类型细胞的分化诱导先后在含有血清和无血清培养液中加入烟酰胺和β-巯基乙醇,可使大鼠骨髓MSCs分化为分泌胰岛素和巢蛋白的胰岛β细胞[27];激活素A,氨基乙磺酸和EGF可诱导骨髓CD90+MSCs在体外分化为光感受器细胞,有视紫红质、视蛋白等特异性基因表达[28];在肝细胞生长因子和制瘤素M作用下人骨髓MSCs在体外可分化为骰状的肝细胞,具有分泌白蛋白、尿素,贮存糖原,摄取低密度脂蛋白等功能[29].3间充质干细胞的分化调节机制至今对MSCs的分化调节机制尚不十分清楚.基因的随机阻遏或诱导模型可能与MSCs分化调节有关[3].体内的某种信号分子,可以增强或抑制MSCs分化信号通路中一些蛋白分子(包括各种激酶和转录因子)的活性而诱导某些基因的表达,进而使干细胞向某一类型细胞分化.上述MSCs的分化诱导剂可能就是通过改变这些蛋白分子的活性而起作用的.3.1参与MSCs分化过程的主要蛋白分子(1)ERK:细胞外信号调节激酶(ERK)在其上游激酶MEK(MAPK/ERKK)的作用下发生磷酸化后被激活.Jaiswal等人[30]报道,人骨髓MSCs是向成骨细胞还是向脂肪细胞分化是由ERK调节的,在用MEK特异性抑制剂PD98059抑制了MAPK通路后,MSCs则分化为成熟的脂肪细胞.骨质疏松病人的p-ERK水平比正常人明显提高,对成骨刺激物的反应性下降[31],也证明了ERK在骨形成中的重要作用.(2)Runx2和Cbfβ:在MSCs向成骨细胞分化、骨形成过程中,Runx2和Cbfβ互相影响,共同起着重要作用.Runx2与DNA的有效结合以及Runx2依赖的转录激活必须有Cbfβ的存在,Cbfβ缺失时,Runx2只能局限调节骨形成.Runx2能通过与含有PuCCPuCA核心序列的特异性增强子区域相结合而直接激活成骨细胞相关基因的转录,如编码骨钙蛋白、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和胶原酶3等的基因[32].过度表达Runx2虽然可以促进软骨内骨化,但只能使成骨细胞处于不成熟的前体细胞状态[33,34].MAPK通路激活,活化的ERK可使Runx2磷酸化而具有活性;cAMP-蛋白激酶途径激活,则可通过泛素的作用使Runx2浓度降低;磷酸化不同部位的氨基第6期唐文洁等:间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展489酸残基,Runx2的转录活性不同,如磷酸化Runx2的一个保守性丝氨酸残基(Ser104),则抑制Runx2的转录活性及其与Cbfβ形成异源二聚体[34].(3)Osx:Osterix(Osx)是一个含有锌指结构的转录因子,在体内成骨细胞分化过程中,具有比Runx2/Cbfa1更高的特异