抗坏血酸含量测定(分光光度计法)

植物生理学模块实验指导李玲主编科学出版社一、维生素C含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】学习利用分光光度计法测定维生素C（抗坏血酸）含量的原理和方法。【实验原理】维生素C（抗坏血酸）具有较强的还原力，可以把铁离子（Fe3+）还原成亚铁离子（Fe2+），亚铁离子与红菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反应形成红色螯合物。此化合物在波长534nm处具有强的吸收峰，且吸光度与反应液中抗坏血酸含量呈正相关。因此，可用比色法来测定抗坏血酸含量。【器材与试剂】1.实验仪器与用具离心机、分光光度计、研钵、电子天平、容量瓶（50ml和100ml）、漏斗、滤纸、离心管、试管。2.实验试剂50g/L三氯乙酸（TCA）溶液：称取5g三氯乙酸（分析纯），用蒸馏水溶解，稀释至100ml。0.4%磷酸-乙醇溶液：量取0.47ml85%磷酸溶液加入到无水乙醇中，并用无水乙醇稀释至100ml。5g/LBP-乙醇溶液：称取0.25gBP（纯度97%）加入到无水乙醇中溶解，并用无水乙醇稀释至50ml。0.3g/LFeCl3-乙醇溶液：称取0.03gFeCl3加入到100ml无水乙醇中，摇匀。100μg/ml标准抗坏血酸溶液：称取10mg抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用），用50g/LTCA溶液溶解，定容至100ml，即1ml溶液含100μg抗坏血酸。现用现配，保存于棕色瓶中，低温冷藏。3.实验材料苹果、梨、香蕉、柑橘等果实。【实验步骤】1.制作标准曲线取7支试管，编号，按表1加入各种溶液，将混合液置于30℃反应60min，然后以0号试管混合液为参照，于波长534nm处测定吸光度值。以抗坏血酸质量为横坐标，吸光度为纵坐标汇至标准曲线，求的回归方程。表1制作抗坏血酸标准曲线试剂含量项目试管号0123456抗坏血酸标准液/ml00.10.20.30.40.50.650g/LTCA/ml2.01.91.81.71.61.51.4无水乙醇/ml1.01.01.01.01.01.01.0混匀、摇匀0.4%磷酸-乙醇溶液/ml0.50.50.50.50.50.50.55g/LBP-乙醇溶液/ml1.01.01.01.01.01.01.00.3g/LFeCl3-乙醇溶液/ml0.50.50.50.50.50.50.5相当于抗坏血酸量/μg01020304050602.提取洗净新鲜果实，吸干，剪碎后混匀，分别称取5g样品置于研钵中，加入20ml50g/LTCA溶液，在冰浴条件下研磨成浆状，转入到100ml容量瓶中，并用50g/LTCA溶液定容至刻度，混合、提取10min后，过滤收集滤液备用。3.测定取1ml样品提取液于试管中，加入1ml50g/LTCA溶液，再按制作标准曲线想通的方法，加入其他成分，进行反应、测定。记录反应体系在波长534nm处吸光度。重复3次。【实验作业】计算不同果实维生素C含量。根据吸光度值，在标准曲线上查出响应的混合液中抗坏血酸质量，按下式计算植物组织中抗坏血酸含量。植物组织中抗坏血酸含量以100g样品（鲜重）中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。抗坏血酸含量=×100（mg/100g）式中，m为由标准曲线求得的抗坏血酸的质量（μg）；Vs为滴定时所用样品中提取液体积（ml）；V为样品提取液总体积（ml）；M为样品质量（g）。【实验扩展】利用此法还可以测定植物组织中脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸的含量。测定原理：利用二流苏糖醇（DTT）将脱氢抗坏血酸还原成还原型的抗坏血酸，这样可以通过测定抗坏血酸的含量对脱氢抗坏血酸进行定量分析。测定方法：取1ml样品中提取液，加入0.5ml60mmol/LDTT—乙酸溶液，再用Na2HPO4-NaOH溶液调p-H至7~8，置于室温下10min，使脱氢抗坏血酸还原。然后加入0.5ml0.2g/ml三氯乙酸溶液，调节平H至1~2.按测定抗坏血酸相同的方法进行测定，计算出总抗坏血酸含量，从中减去样品中原有的还原型抗坏血酸含量，即得脱氢抗坏血酸含量。V×mVs×M×1000