生理实验设计

实验设计：激素对血糖浓度的影响——以家兔为例的实验设计实验目的：学习对家兔采血和注射方法，了解血糖浓度测定方法，验证激素对血糖浓度的调节。实验原理：对血糖产生影响的激素有很多，其中使血糖浓度降低的激素为胰岛素;使血糖浓度升高的激素有胰高血糖素、肾上腺素、肾上腺皮质激素、生长素、甲状腺素。它们对血糖的调节主要是通过对糖代谢各主要途径的影响来实现的。本实验将家兔作为实验对象，对其进行空腹采血后分别注射各激素，作用一段时间后再分别采血，同时观察注射激素前后的家兔血糖浓度的变化，以验证激素的调节作用。萄糖氧化酶（GOD）将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶（POD）和色素原性氧受体存在下，将过氧化氢分解为水和氧，同时使色素原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，其色泽深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比。其反应式如下：葡萄糖+O2（GOD）—→葡萄糖酸+H2O2实验对象：家兔实验试剂：胰岛素注射液（40单位/ml）、胰高血糖素注射液、肾上腺素注射液（1︰1000）、生理盐水、肝素抗凝剂（配成2500单位/ml）、凡士林、二甲苯、葡萄糖标准应用液（5.55mmol/L）、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)、酶试剂、酚溶液、酶酚混合试剂、12mmol/L苯甲酸溶液、100mmol/L葡萄糖标准贮存液实验器材：适量规格注射器、台式磅秤、兔手术台、刀片、干棉球、纱布、试管、试管架、沸水浴实验操作：1.动物准备及空腹采血取试管8支，编号1-8，分别加入肝素抗凝剂0.0lml。取空腹16小时以上的正常家兔四只，分别编号a、b、c、d，称体重（一般是2-3kg）并记录。用耳静脉采血法：先拔去兔耳缘静脉处的毛，再用二甲苯擦拭兔耳部静脉，使其充血，在其周围抹上凡士林(防止污染、润滑），用刀片轻轻挑破边缘耳静脉，放血入含抗凝剂的试管1～4，约需2-3ml，边滴边摇，以防凝固。取血完毕，用干棉球压迫血管止血2．注射激素并再采血注射液生理盐水胰岛素胰高血糖素肾上腺素取血时间a0.4mg/kg——————30minb——4单位/kg————1hc————0.4mg/kg——30mind——————0.4mg/kg30min皮下注射，观察兔子情况。经各自取血时间后，心脏取血入抗凝管5-8中。采血方法同上。3.测定注射前后的血糖取8支干燥试管，编号。将收集的8管血液用离心机离心10分钟(每分钟2500转)，取上层血浆，分别制成1-8共8管标本。用葡萄糖氧化酶法测血糖，混匀，置37℃水浴中，保温15min，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。空腹血清葡萄糖为3.89～6.11mmol/L。取血后立即腹腔或皮下注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔发生胰岛素性休克而死亡。血液葡萄糖mmol/L=测定管吸光度／标准管吸光度×5.55注意事项：1.离心机的使用⑴.离心前一定要配平（位置配平和重量配平）。⑵.使用时离心机的盖子一定要盖紧，以免发生意外。⑶.要等离心机完全静止后才能打开盖子。2.血清或血浆应在采血后及时与细胞分离，以避免血清或血浆中葡萄糖被细胞利用而降低。3.血糖测定应在取血后2h内完成，血液放置过久，糖易氧化分解，致使含量降低。临床意义：1.血糖升高：病理性主要见于糖尿病，其他内分泌疾病如肾上腺皮质机能亢进，垂体前叶机能亢进等。2.血糖降低：病理性如胰岛细胞瘤、胰岛素分泌过多，过量胰岛素治疗，肾上腺皮质功能减退等。问题讨论：1)实验对象为什么选择家兔？取四只的理由是什么？2)对家兔取血为什么选择耳缘静脉？3)加不同的激素之后取血的时间为什么不一样？4)三种激素的作用机理分别是什么？5)除了实验设计的三种激素，还有哪些激素可以有相关作用？实验报告预期实验结果：用药前家兔的血糖浓度作为参照；b组家兔血糖浓度明显降低至低与参照浓度；c,d组家兔血糖浓度明显升高至高于参照浓度；a组家兔血糖浓度略微下降。A中加入生理盐水与BCD形成空白对照，加入生理盐水与无生理盐水区别是减少误差。在动物体内，多种激素参与对血糖浓度的调节。本实验中，胰岛素会使血糖浓度降低，家兔出现相应的低血糖症状，可能有虚弱、发抖、激动、震颤、心跳加速、抽筋、情绪激动、恐惧、惊厥、抽搐、嗜睡（甚至昏迷死亡）；肾上腺素、胰高血糖素使血糖升高，出现相应的高血糖症状，可能有尿量增多，恶心，呕吐，虚弱无力，心跳快速，呼吸缓而深。实验分析：神经系统对血糖浓度的调节作用主要通过下丘脑和自主神经系统对所控制激素的分泌，后者再通过影响血糖来源与去路关键酶的活性来实现。神经系统的调节最终通过细胞水平的调节来达到目的。下丘脑一方面通过内脏神经作用于肾上腺髓质，刺激肾上腺素的分泌；另一方面也作用于胰岛α-细胞，使其分泌胰高血糖素；同时还可以直接作用于肝。三方面共同作用的结果是使肝细胞的磷酸化酶活化，使糖原分解加速；糖异生关键酶的活性增加，糖异生作用增加，从而使血糖浓度升高。下丘脑还可通过兴奋迷走神经，使胰腺β-细胞分泌胰岛素，同时还可直接作用于肝，使肝细胞内糖原合成酶活化，促进肝糖原的合成；此外还抑制糖异生途径，促进糖的氧化和转化，总体上使血糖的去路增加，来源减少，最终达到使血糖浓度降低的目的。使血糖浓度降低的激素：胰岛素。使血糖浓度升高的激素：胰高血糖素、肾上腺素、肾上腺皮质激素、生长素、甲状腺素。它们对血糖的调节主要是通过对糖代谢各主要途径的影响来实现的。在激素发挥调节血糖浓度的作用中，最重要的是胰岛素和胰高血糖素。肾上腺素在应激时发挥作用，而肾上腺皮质激素、生长激素、甲状腺素等都可影响血糖水平，但在生理性调节中仅居次要地位。胰岛素：使肌肉和脂肪组织细胞膜对葡萄糖的通透性增加，利于血糖进入这些组织进行代谢。诱导葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的合成，加速细胞内葡萄糖的分解利用。通过使细胞内cAMP含量减少，激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶系，抑制磷酸化酶和糖异生关键酶等，使糖原合成增加，糖的氧化利用、糖转变为脂肪的反应增加，血糖去路增快；使糖原分解和糖异生减少或受抑制，使血糖来源减少，最终使血糖浓度降低胰高血糖素：主要通过提高靶细胞内cAMP含量达到调节血糖浓度的目的。细胞内的cAMP可激活依赖cAMP的蛋白激酶，后者通过酶蛋白的共价修饰改变细胞内酶的活性，即激活糖原分解和糖异生的关键酶，抑制糖原合成和糖氧化的关键酶，使血糖升高。肾上腺素:通过cAMP激活肝中糖原磷酸化酶使糖原分解，还有诱导肝中磷酸烯醇式丙酮酸激酶及果糖二磷酸酶的合成促进糖异生作用，使氨基酸转化成葡萄糖，从而使血糖上升。实验讨论：1)家兔正常体温39.0(38.5～39.50)℃、皮肤温度33.5～36℃，心跳频率258±2.8次/分，动脉血压110（95～130）mmHg，循环血量59±2.3ml/Kg体重，呼吸频率51（38～60）次/分。家兔耳大、血管清晰，便于注射和取血。设置四只为了在纵向比较的同时也作横向对比。2）耳缘静脉操作简单、动物不需特别固定和麻醉。3）因为不同激素的作用机理不同，作用效果和时间也就不尽相同，详情参考各激素作用具体机理。4）胰高血糖素主要通过提高靶细胞内cAMP含量达到调节目的。细胞内的cAMP可激活依赖cAMP的蛋白激酶，后者通过酶蛋白的共价修饰改变细胞酶的活性，即激活糖原分解和糖异生的关键酶，抑制糖原合成和糖氧化的关键酶，使血糖升高。肾上腺素通过cAMP激活肝中糖原磷酸化酶使糖原分解，还有诱导肝中磷酸烯醇式丙酮酸激酶及果糖二磷酸酶的合成促进糖异生作用，使氨基酸转化为葡萄糖，从而使血糖升高。使肌肉和脂肪组织细胞膜对葡萄糖的通透性增加，利于血糖进入这些组织进行代谢诱导葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的合成、通过使细胞内cAMP含量减少，激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶系，抑制磷酸化酶和糖异生关键酶等，使糖原合成增加，糖的氧化利用，糖转变为脂肪血糖的反应加快，去路增快；使糖原分解和糖异生减少或受到抑制，使糖原来源减少，最终使血糖浓度降低。5）可能还与生长激素、生长抑素及肾上腺皮质激素等有关。生长素具有升糖作用，能抑制外周组织对葡萄糖的利用，增强脂肪酸的氧化，减少葡萄糖的消化。血糖升高可使其浓度降低。生长抑素:由胰岛B细胞分泌，主要通过抑制胰岛素和胰高血糖素的分泌来发挥作用。肾上腺皮质激素包括糖皮质激素：由肾上腺皮质分泌，可促进肌肉蛋白质分解，抑制蛋白质合成；并促进蛋白质、脂肪在肝脏内转变为糖原和葡萄糖。抑制肝外组织摄取葡萄糖，从而提高血糖。实验课题：激素对血糖浓度的影响生理实验设计第二组