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动脉粥样硬化相关环状RNAcircANRIL调控核糖体RNA成熟作用过程8月19日，NatureCommunications杂志在线发表了德国慕尼黑Ludwig-Maximilians大学DanielTeupser教授的一项环状RNA研究的重要工作。报道发现动脉粥样硬化相关的一种环状RNA：circANRIL可以调控核糖体RNA的成熟作用(Holdtetal.,2016)。已有的文献表明9号染色体短臂p21区域（9p21）是人类动脉粥样硬化疾病相关的重要基因座，非编码RNAANRIL(CDKN2B-AS1)就位于该区域，该基因也可以形成环状RNA。线性的ANRIL（linANRIL）表达增高与动脉粥样硬化有关。在linANRIL中存在Alu元件，且该元件在灵长类动物中相对保守，暗示可能是一种功能获得性基因进化结果。基于这一系列的研究背景，作者提出重要的科学问题：ANRIL基因的环状RNA是否与动脉粥样硬化疾病有关？本文通过蛋白质组学筛选，生物信息学分析和功能验证最终发现circANRIL能够调控核糖体RNA的成熟过程，影响核糖体生成和核仁压力，最终影响动脉粥样硬化疾病进程。作者首先针对ANRIL基因外显子区形成不同形式的环状RNA进行系统分析，发现存在多种形式的环状RNA分子。 图1ANRIL基因外显子对应的环状RNA分子（来自(Holdtetal.,2016)）进一步在不同组织和细胞系中鉴定circANRIL的表达量，表明外显子5,6,7所形成的环状RNA是含量最丰富的形式，作者将外显子5,6,7环化形成的环状RNA定义为circANRIL。 图2ANRIL基因对应的不同环状RNA在不同组织和细胞中表达分析（来自(Holdtetal.,2016)）进一步分析circANRIL表达量，表明circANRIL表达量大约是linANRILRNA的表达量的9.7倍，比著名的环状RNACDR1as及circHPRT1的表达量还要高。这说明circANRIL是表达丰度相对较高的非编码RNA分子。 图3circANRIL表达量定量分析（来自(Holdtetal.,2016)）作者也进行了荧光原位杂交分析（FISH），表明circANRIL在动脉粥样硬化血管组织中存在高表达。 图4荧光原位杂交分析circANRIL组织表达特异性（来自(Holdtetal.,2016)）由于9p21染色质区是动脉粥样硬化对应的基因座区域，circANRIL是否直接参与了动脉粥样硬化疾病过程还需要进行临床遗传学分析。因此作者接下来就在一定数量的病人标本中分析circANRIL与临床症状之间的对应关系。作者利用冠状动脉造影技术分析患者冠状动脉粥样硬化的程度。结果表明9p21相关的患者的circANRIL表达水平在外周血单个核细胞中明显增高（n=1933）。这一系列数据表明9p21，circANRIL表达增高以及CADprotection之间存在关联性。 图5定量PCR分析circANRIL表达量与临床症状的对应关系（来自(Holdtetal.,2016)）A：Protective;H.heterozygote;G.riskcircANRIL是否发挥生物学功能是作者接下来需要回答的基本问题。作者首先构建了过表达载体，作者构建该载体的策略是在外显子5的上游及外显子7的下游各延长140bp进行克隆表达，最终在HEK-293细胞中鉴定到过表达的克隆，过表达效率平均约16倍。作者挑选了过表达效率在3倍左右的克隆，以模拟接近生理状态的水平。作者也用放线菌素D抑制RNA聚合酶II的活性，看RNA降解的速率，结果表明circANRIL要比线性的ANRIL的RNA稳定得多。过表达circANRIL后细胞凋亡增多，增殖减慢，而对照的circHPRT1过表达后则没有这方面的影响。RNA干扰circANRIL后凋亡减少和增殖增多。 图6过表达circANRIL可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖（来自(Holdtetal.,2016)）由于环状RNA表达量本身就非常低，RNA干扰实验可能会存在渗漏表达的情况，虽然在PCR实验中检测到，但依然不能完全排除极低含量的circANRIL存在并干扰实验结果的可能性，因此，为了更严谨的证明circANRIL的功能，作者进行了CRISPR/Cas-9基因打靶，得到了不同纯合型或杂合型的ANRIL基因外显子5-20敲除的HEK-293细胞株。这些细胞株细胞凋亡和增殖实验的结果与RNA干扰circANRIL的结果相同。而在这些敲除克隆中过表达circANRIL则能大大提高细胞凋亡的活力，抑制自爆增殖。但这些实验体系中线性RNA均同时因为敲除外显子5-20而被沉默。这一系列实验有力的证明了circANRIL在调控细胞凋亡和增殖过程中的作用。 图7ANRIL基因打靶实验（来自(Holdtetal.,2016)）a.Cas-9打靶模式图；b.打靶效率鉴定；c.敲除外显子5-20后细胞凋亡检测；d.敲除外显子5-20后细胞增殖检测；e.敲除外显子5-20后过表达circANRIL细胞凋亡检测；f.敲除外显子5-20后过表达circANRIL细胞增殖检测。有文献报道表明ANRIL基因可能会影响CDKN2A和CDKN2B基因，于是作者进一步分析了circANRIL对它们的影响情况。作者首先排除了circANRIL影响线性linANRIL的可能性，然后在过表达circANRIL的细胞中分析CDKN2A和CDKN2B基因的表达量，结果表明circANRIL过表达并不影响CDKN2A和CDKN2B基因的表达。预测分析表明circANRIL存在三个可能的miRNA结合位点，但过表达circANRIL并不影响这些microRNA的表达。circANRIL也不结合AGO2，因此可以排除circANRIL作为miRNAsponge功能的可能。 图8circANRIL不影响CDKN2A和CDKN2B基因表达，也通过结合microRNA起作用。（来自(Holdtetal.,2016)）线性的linANRIL是可以结合蛋白的，于是作者设计了一系列实验分析circANRIL结合蛋白的情况。作者构建了携带BoxB元件的过表达载体，BoxB元件可以结合 -N-peptide，从而可以利用免疫沉淀的方法实现circANRIL相互作用蛋白的钓取和蛋白质组学分析。作者将BoxB元件构建到外显子6中。 图9circANRIL结合蛋白分析实验过表达载体构建（来自(Holdtetal.,2016)）过表达后BoxB元件可以稳定的存在于环状RNA中，作者也利用定量PCR的实验验证了免疫沉淀过程中目标环状RNA被富集的情况。利用免疫沉淀的方法分离与circANRIL相互作用的蛋白，需要排除非特异性的结合的情况，作者选择了不带BoxB的过表达circANRIL细胞裂解体系做对照，可直接排除 N非特异性结合的蛋白。 图10circANRIL相互作用蛋白分析技术体系（来自(Holdtetal.,2016)）利用该实验体系，作者鉴定到32个互作蛋白，主要的是核糖体相关蛋白（12种），还有RNA加工相关的蛋白（5种）。依据聚类分析的结果，作者推断circANRIL可能与核糖体生成及RNA加工过程有关。与circANRIL作用力最强的是NOP14和PES1，两者分别在核仁中参与40S和60S核糖体亚基的组装合成过程，其中PES1所在的复合体PeBoW负责了47S核糖体RNA前体加工成28SrRNA和5.8SrRNA的过程。此外，BOP1、BRIX1和NOLC1也都在钓取到的互作蛋白中。作者也利用RIP实验反向验证了几个蛋白与circANRIL相互作用的可重现性，结果表明PES1是几个蛋白中作用最强的。BoxB标记的circANRIL进行RNAPull-down后Western实验也证明了确实与PES1有相互作用，但NOP1没有检测到。 图11circANRIL相互作用蛋白（来自(Holdtetal.,2016)）左：几个核糖体生成相关的蛋白在互作蛋白中的分布；中：RIP实验结果；右：Western鉴定PES1。PES1在rRNA加工过程中主要负责从36S中间体体加工为32S中间体直至形成成熟的18SrRNA的过程。 图12哺乳动物核糖体RNA加工过程示意图（来自(Holdtetal.,2016)）如果PES1受到抑制，就会导致36S和32S两个中间体RNA的积累。于是作者利用QPCR实验分析了过表达circANRIL后36S和32S两种中间体rRNA的含量变化，以47S和7SL为为对照，circHPRT1为非特异性circRNA对照。结果如预期，36S和32S两个中间体在过表达circANRIL后明显增多，RNA干扰circANRIL后则减少。进一步说明circANRIL通过与PES1相互作用抑制后者的功能。 图13过表达或敲低circANRIL后不同rRNA中间体含量变化（来自(Holdtetal.,2016)）核糖体生成如果收到抑制，会导致核仁压力，表现为核仁增多，体积变小。于是作者利用免疫荧光检测了PES1，过表达circANRIL后核仁明显变多，体积变小，但在Vector对照以及circHPRT1非特异性对照中均没有明显变化。这说明过表达circANRIL可导致核仁压力。 图14过表达circANRIL导致核仁压力（来自(Holdtetal.,2016)）作者还观察到过表达circANRIL会导致p53入核，这在接下来的脉冲标记定量蛋白组学分析（PulseSILAC）及转录组学分析中也得到了证实。 图15过表达circANRIL后激活p53（来自(Holdtetal.,2016)）作者发现circANRIL和rRNA之间存在一定的序列同源性。由于circANRIL和rRNA前体和中间体RNA均可结合在PES1蛋白上，有没有可能这两种RNA分子之间会存在相同的结合位点，从而存在竞争性结合PES1的关系？作者选择了两种算法验证了circANRIL结合PES1的区域与rRNA中间体存在同源性。PES1的N-端和C-端结构域可能是它们相互做作用的区域。 图16circANRIL与rRNA成熟中间体存在序列同源性，可竞争性结合PES1（来自(Holdtetal.,2016)）为进一步验证该假设，作者构建了不同的PES1截短型突变体，结果表明只有当PES1蛋白存在C-端的446–588位氨基酸时，才能检测到与circANRIL存在相互作用，而该区域正是rRNA加工中间体RNA分子结合的区域。 图17PES1蛋白截短型突变分析（来自(Holdtetal.,2016)）e.截短型PES1免疫沉淀分析circANRIL结合情况；f.g.截短型PES1免疫沉淀分析rRNA中间体结合情况；h.过表达各种截短型PES1对p53激活情况影响；i.过表达各种截短型PES1对细胞凋亡的影响；j.过表达各种截短型PES1对细胞增殖的影响。ANRIL基因在进化中并不保守，外显子5-7仅仅在灵长类中相对保守。由于circANRIL在小鼠中没有检测到，因此作者采用了人原代SMC细胞以及通过iPS诱导分化获得的巨噬细胞分析了circANRIL的功能。结果表明，SMC中过表达circANRIL可引起核仁压力，表现为核仁增多，体积变小，rRNA前体分子积累。过表达circANRIL可促进细胞凋亡，增殖减缓。 图18过表达circANRIL对人原代SMC的影响（来自(Holdtetal.,2016)）a.过表达circANRIL导致核仁增多，体积减小；b.核仁数目统计；c.核仁体积统计；d.过表达circANRIL导致rRNA加工中间体36S和32SRNA增多；f.过表达circANRIL诱导细胞凋亡；g.过表达circANRIL抑制细胞增殖；h.circANRIL表达量与细胞凋亡的关系；i.circANRIL表达量与细胞增殖的关系；j.iPS分化获得的巨噬细胞中过表达circANRIL导致rRNA前体分子聚集；k.iPS分化获得的巨噬细胞中过