醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

浙江工业大学生物与环境工程学院第九届“昂立杯”学生课外学术科技作品竞赛醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达作者：童小龙所在班级：生物工程0803小组成员：林浩、马斌祥指导教师：柳志强2010年11月摘要：本研究根据已知的编码醛缩酶的基因序列，设计一对特异性引物，以实验室保藏菌株ZJUTB-DERA的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到约750bp的片断，将该片断与克隆载体pMD18-T连接并测序，根据测序结果，重新设计一对引物，并在两端加上NcoI和SalI的识别位点序列，通过PCR获得长度为684bp的醛缩酶编码基因，将所得片断定向克隆至pET28b载体中，转化至BL21感受态细胞中，筛选出了阳性克隆子。利用IPTG对阳性菌进行诱导，并对表达产物进行了分离纯化，SDS-PAGE电泳检测出在约24kD处有一蛋白表达带，对重组基因工程菌的酶进行测定，结果为133.8U。关键词：2-脱氧核糖-5-醛缩酶、基因克隆、表达、酶的纯化引言他汀类药物(Statins)是20世纪80年代后期开发的一种降血脂药物，作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，通过与该酶竞争性结合，使HMG-CoA无法转变成甲羟戊酸(Mevalonate)，甲羟戊酸是合成内源性胆固醇的原料，从而阻断胆固醇的合成，降低血胆固醇的水平。此外，他汀类药物还具有降低甘油三酯、提升高密度脂蛋白水平等重要作用，因此，他汀类药物在预防和治疗冠心病、动脉粥样硬化等方面有着广泛的应用。另外有研究显示，他汀类药物还可以影响肿瘤细胞的生存与发展，具有一定的抗肿瘤作用。据统计数据表明，在调/降血脂药物市场中，他汀类原料药所占的市场份额约为180多亿美元，占全球调/降血脂类药物60%的市场份额。因此，随着部份药物专利到期，各制药企业和相关研究机构积极投身于他汀类药物的生产和研发。目前全球已开发的他汀类药物有十多个品种，如洛伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀等，从各类他汀的化学结构中发现它们普遍都具有一个手性的侧链基团，其结构是二羟基酸或是（杂）环芳香内酯。由于在化学合成该手性侧链的过程存在着成本高、污染严重，反应步骤长，合成收率低，副反应多，产品分离纯化难度大等缺点。同时，随着生物催化与生物转化研究的飞速发展，结合生物酶法与化学法合成他汀侧链逐渐成为研究热点。醛醇缩合反应是碳碳键生成的有效反应之一，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC4.1.2.4)则是不对称直接醛醇缩合反应的高效催化剂，它可以在水溶液中、中性pH条件下催化不对称碳碳键的形成，因此受到研究者的广泛关注。DERA是一种无需磷酰化体的独特的生物催化剂，它可以催化D-甘油醛-3-磷酸与乙醛反应生成2-脱氧-D-核糖-5-磷酸酯。该醛缩酶正在成为强大的用于工业合成手性分子的工具，它可以利用乙醛或和2-取代乙醛为底物，通过4-取代-3-羟基正丁醛中间产物来生产2,4,6-三脱氧己糖或其衍生物。此类2,4,6-三脱氧己糖及其衍生物是他汀侧链的合成前体。与其它酶类相比，DERA合成他汀侧链具有原料结构简单易于检测分析，且来源丰富、价格低廉等优点。目前研究最多的是利用乙醛和氯乙醛反应生产6-氯-2,4,6-三脱氧吡喃糖苷。利用DERA催化的羟醛缩合反应来生产他汀侧链具有一定的不足之处，主要表现为生产能力低，原因是该酶对醛类物质（包括乙醛、氯乙醛等）的耐受性较差，在高浓度底物存在下，醛缩酶极易失活。在研究初期，该反应是在低底物浓度，低温（2-4℃），高酶浓度下，经过7天的反应时间，才达到100g·L-1的产物浓度。本文作者根据NCBI公布的醛缩酶编码基因序列，设计了一对引物，利用实验室保藏菌株ZJUTB-DERA的基因组DN为模板，扩增得到了编码醛缩酶编码的基因序列，并构建了含有编码醛缩酶结构基因的原核表达载体pET28b-DERA，成功地使其在E.coliBL21中进行了活性表达，本文报道有关研究结果。1材料与方法1.1工具酶和试剂基因组提取试剂盒购自MP公司，质粒提取盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自Axygen公司，各种工具酶均购自Takara（宝生物）公司，配制微生物培养基所用酵母粉、蛋白胨为OXOID公司产品。1.2质粒，菌株与培养条件所用克隆载体为pMD18-T，表达载体为pET28b，宿主大肠杆菌为JM109(recA1sμpE44endA1hsdR17gyrA96relA1thi△(Lac—proAB)F’[traD36proAB+lacIqlacZ△M15])和BL21(DE3)(F-，ompT，hsdS(rBB-mB－)，gal，dcm(DE3))，均为本实验室保存。LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5，pH7.0。需要时使用前加入100μg/mL氨苄青霉素(Amp)或卡那霉素(Kan)，固体培养基添加2%琼脂，用于大肠杆菌培养。1.3酶缩酶基因的克隆1.3.1ZJUTB-DERA基因组DNA的提取从甘油管中吸取100μL的保藏菌种，加入到LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养越24h，收集菌液，采用快速核酸提取仪及微生物基因组提取试剂盒提取ZJUTB-DERA的基因组DNA。1.3.2PCR反应条件PCR反应体系各组分加入量（总体积50μL）：10×TaqBuffer5μL，10mMdNTPmixture1μL，克隆引物1，2各1μL，基因组DNA1μL，TaqDNA聚合酶1μL，无核酸水40μL。采用Biorad的PCR仪，PCR反应参数为：94℃30s，55℃30s，72℃60s，重复30个循环后，取5μL用0.9%琼脂糖凝胶电泳检测。1.3.3目的片段的回收PCR产物约50μL，用1%的琼脂糖电泳回收目的片段。利用DNA胶回收试剂盒进行回收，方法参见DNA胶回收试剂盒说明书。1.3.4克隆载体的构建与鉴定将回收的目的片段同载体pMD18-T进行连接，具体方法按pMD18-T载体试剂盒说明书进行，构建重组质粒pMD18-T-DERA。然后将重组质粒热击转化到E.coliJM109宿主菌中。将转化后的菌液涂布到含24μg/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside,IPTG)、50μg/mL氨苄青霉素(Amp)、40μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside，X-gal)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。利用蓝白斑筛选，从平板上挑取白色菌落，提取质粒后用自动序列仪进行测序(由大连宝生物公司完成)，并用DNAMAN软件分析测序结果。1.4酶缩酶基因的表达1.4.1表达载体的构建与鉴定在1.3.4测序结果的基础上，设计引物3及引物4。利用引物3引物4，以pMD18-T-DERA为模板扩增醛缩酶结构基因，PCR反应参数为：94℃30s，54℃30s，72℃60s，重复30个循环后72℃继续延伸10min。用0.9%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。1.4.2目的片段的回收：方法同1.3.3。1.4.3表达载体的构建纯化后的醛缩酶结构基因用NcoI和SalⅠ37℃酶解6h，用DNA回收试剂盒回收684bp的DNA片段。将pET28b质粒用NcoI和SalⅠ37℃酶解6h，用DNA回收试剂盒回收。将回收的目的片段和载体质粒连接，构建表达载体pET28b-DERA。1.4.4阳性克隆的筛选将1.4.3中构建好的表达载体10μ加至100μLE.coliBL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上静置30min，42℃水浴静止热击90s，迅速转移至冰上静置2min，加入800μLLB培养基，转移至37℃摇床，250rpm温育60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标志基因。取适当体积已转化的感受态细胞涂布于含有Kan抗生素的LB平板上，将平板置于室温直至液体被全部吸收，倒置平板，于37℃培养过夜。从平板上筛选阳性菌落，接种于含100μg/mLKan的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。从菌液中提取质粒，用NcoI和SalⅠ37℃酶解6h，对酶解产物电泳检测。1.5醛缩酶的诱导表达挑取阳性克隆单菌落并接种于5mL含有浓度为50µg/mLKan的LB液体培养基中，于37℃、250r/min振荡过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有浓度为50µg/mLKan的LB液体培养基中37℃、250r/min振荡至菌体浓度OD600约为0.6～0.8左右。向培养物中加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L诱导培养。离心收集菌体备用。1.6醛缩酶的分离纯化用冰上预冷了的缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，500mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0)按10mL/g细胞比例重悬融化的细胞团，置于冰水浴中进行超声破碎。破胞结束后，于4℃离心(12000r/min，20min)去除细胞碎片，所得上清液即为粗酶液。上清液由0.22μm的滤膜(Millipore)过滤，用缓冲液A平衡镍离子亲和层析柱，流速1.0mL/min，将粗酶液上柱(约30mg蛋白/mL)，用缓冲液A冲洗10个柱体积后，用缓冲液B(100mM磷酸钠缓冲液，200mMNaCl，500mM咪唑，pH8.0)洗脱，得到酶液I，利用透析袋将酶液I中的高浓度咪唑及NaCl置换为水溶液，将最终得到的酶溶液分装后-80℃保存。1.7表达产物SDS-PAGE分析以转入空载体的E.coliJM109菌体作为对照。鉴定为阳性的E.coliBL21(DE3)/pET30a-DERA经IPTG诱导培养后，取1mL诱导培养物，离心收集菌体，重悬于50µL蒸馏水中，加入50µL上样缓冲液，混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色。1.8酶活检测收集诱导后重组大肠杆菌BL21/pET-28b-DERA菌体，悬浮于pH7.0的磷酸盐缓冲液中，超声破碎后作为转化用酶，以乙醛为底物，进行转化反应制备2,4,6-三脱氧己糖。转化体系及转化操作如下：在50ml转化瓶中加入10ml细胞破碎液，加入终浓度为150mM的乙醛，30℃下，150r/min转化60min，加入丙酮终止反应。利用气相检测乙醛的浓度，酶活单位(U)定义为：在30℃条件下，1min内催化1µmol乙醛生成2,4,6-三脱氧己糖所需要的酶量定义为1U。2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的酶活以每mg干菌体所含有的酶活力单位表示(U/mg)。根据体系中乙醛的消耗量推知重组菌酶活。2结果2.1基因组DNA的提取及PCR扩增采用快速核酸提取仪及微生物基因组提取试剂盒来提取ZJUTB-DERA的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，利用克隆引物1、引物2进行PCR扩增。扩增产物进行0.9%的琼脂糖凝胶电泳，发现在750bp处出现明亮的特异性条带。2.2PCR产物克隆将利用胶回收的DERA结构基因片段与pMD18-T载体连接，构建克隆载体pMD18-T-DERA并转化至E.coliJM109受体菌，涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，平板上长出许多蓝、白色菌落。随机挑取白色克隆提取质粒进行测序(结果未列出)，利用序列分析软件对测序结果进行分析，发现该序列含有一个开放阅读框(OpenReadingFrame，ORF)。为了进一步研究醛缩酶酶基因，根据测序结果设计了引物3、引物4，用以扩增醛缩酶结构基因。2.3表达载体的构建将引物3、引物4扩增得到的PCR产物及载体pET28b分别用限制酶NcoⅠ和SalⅠ酶切，酶切产物纯化后进行连接，构建表达载体pET28b-DERA，结构示意图见图1，转化至E.coliBL21受体菌，37℃培养过夜，随机挑取8个转化子接种到含100μg/mLKan的LB培养基中，提取重组质粒，用限制酶对重组质粒进行鉴定，pET28b-DERA能被NcoⅠ和SalⅠ双酶切获得一条68