免疫印迹(Western-Blot)的基本原理、实验步骤

活性蛋白整体方案网址：免疫印迹(WesternBlot)的基本原理、实验步骤WesternBlot原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。实验操作(一)配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP及TEMED即可。3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后静置至胶凝固。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O活性蛋白整体方案网址：冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。30min后上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉)(二)样品处理1.培养的细胞（定性）：1)去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。2)对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loadingbuffer。3)用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。4)用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。5)待样品恢复到室温后上样。2.培养的细胞（定量）：1)去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。2)加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。3)用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。4)12000g离心，4℃，2min。5)取少量上清进行定量。6)将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。3.组织：1)心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。2)12000g离心，4℃，2min。3)取少量上清进行定量。4)将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，每次上样前98℃，3min。(三)电泳1)所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×活性蛋白整体方案网址：调整至与样品等体积。2)以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。3)在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。(四)转膜1.电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1000ml。干转则取此转移液，每50ml加入180ul10%SDS。浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，待其自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。2.取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶，左上切角，在转移液中浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与膜每侧的一张（干转每侧三张）滤纸。用玻棒逐出气泡后剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）。3.转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。干转：电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。电转液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L活性蛋白整体方案网址：(五)封闭及杂交1)封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，放于封闭液中缓慢摇荡一小时。2)结合一抗：将含有一抗的封闭液滴加在摇床的塑料膜上，从封闭液中取出Western膜，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要产生气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。3)洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。4)结合二抗：选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。5)洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。(六)发光鉴定1.HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。2.AP-NBT/BICP显色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。