流式细胞技术基本原理及应用

流式细胞仪基本原理及应用——检测标准化，结果更准确，操作更简单提纲BeckmanCoulter公司介绍流式细胞技术基本原理FC500全自动分析型流式细胞仪介绍Gallios十色分析型流式细胞仪流式细胞技术科研应用Dr.Beckman于1935年创立Beckman公司Coulter兄弟于1958年创立Coulter公司1997年两大公司合并为BeckmanCoulter一直致力于为生命科学研究提供全套的解决方案，产品涵盖临床诊断和生物医学的多个领域，包括临床生化、血凝/血球、实验室自动化、离心机、流式细胞产品、基因组学、蛋白质组学、颗粒特性分析等20多万台仪器设备在全球130多个国家地区的医院和科研院所高效运转年销售额超40亿美金，被财富杂志评为“最值得钦佩的公司”之一名列全球福布斯500强BeckmanCoulter公司介绍BeckmanCoulter：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商贝克曼库尔特细胞组学产品线Z1/Z2细胞分析计数仪Vicell全自动细胞活力分析系统4色数字化分析型流式EpcisXL5色数字化分析型流式FC500EPICSALTRA™分选Gallios™科研型MoFloXDP高端分选MoFloAstrios高端分选QuantaSC（2007）临床型NaviosCyAnADP（科研型）1990200520092009年12月份上市流式细胞技术基本原理WhatisFlowCytometry？流式细胞技术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术。它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。FCM的技术特点测量速度快以单一细胞为分析基础多参数测量统计学意义高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF（MoleculesofEquivalentSolubleFluorochrome），前向角散射光检测灵敏度(0.2∼0.5µm)分选纯度可达99%以上细胞的相对大小（FSC-ForwardScatter）细胞的相对颗粒度和内部复杂度（SSC-SideScatter）细胞的相对荧光强度WhatCanaFlowCytometerTellUsAboutaCell?FC500流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体流式细胞仪是细胞组学的定量工具可以做以下定量：细胞相对定量（％）细胞绝对定量（细胞/µl）细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞）可溶性蛋白绝对定量（g/ml）荣获国际工业设计大奖和质量最高奖，得到国际公认获得FDA和中国SDA认证，安全性和结果可靠性得到肯定全自动5色流式细胞仪Cytomics™FC500FlowCytometer先进的光路设计高分辨20Bit数字化电子系统丰富灵活的进样系统基于Windows界面的高度人性化软件FC500Flowcytometry的基本结构流路：流动室鞘液sheath样本流sample光路：光源光学收集系统电路：光电倍增管(PMT)、光电二极管、放大器（线性、对数）A/D转换（光信号转换为电信号之后的处理分析道数和电信号的脉冲转换）统计：计算机软件流路流动室侧向及荧光信号前向散射光信号鞘液激光•样品管、鞘液管和流动室等由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上——流体动力学聚焦FC500的光源和光路先进的单激光激发5色系统单激光就能激发5色荧光20mW@488nmBlueair-cooledargon(氩离子激光)单激光同时激发5色荧光，确保信号来源于同一个细胞，结果准确可靠其它公司同档机器单激光只能激发4色，第5色需要安装第二根激光激发。由于有两个检测点，在鞘液压力变化、样品浓度、样品大小不均、转换采样速度时不能确保信号来源于同一个细胞而是两个细胞，信号收集发生错误双激光排列方式：共线性排列（只有一个检测点）FC500的光源和光路488nm激光633nm激光双激光共线性：信号来源于一个检测点散射光测量原理RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSourceFSCSensorLaserSSCSensor散射光的性质波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，可依此对未染色的细胞进行分析--前向散射光(FSC):与细胞大小有关--侧向散射光(SSC):与细胞内部的结构及颗粒性有关。SCFS外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）FC500提供两种检测角度的前向角散射光，更好通过大小区分不同细胞荧光信号检测原理520nmFSCSensorLaserFluorescenceSensorPMT(FL)excitedelectronENERGYEMITSENERGYASLIGHTATOM荧光素及荧光发生机理简介FITC荧光素的激发和发射光谱Ex488nmEm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号FC500流式常用荧光染料violetbluegreenyelloworangeredinfra-FITC520PE575ECD615PC5665LASER488PI620400-450l450-500l500-570l570-590l390l590-620l620-750l750lPC7770荧光素的使用：选择正确的激光器确定正确的滤光片确定所需荧光探测器（PMT）LONG(700nm)(550LP)(550SP)SHORT(500nm)DichroicFiltersTransmitted550nm550nmDiflected90°550nm550nmLONG(700nm)(500LP)(500SP)SHORT(500nm)PassThroughFilters(500/50)Transmitted500nm500nm475-525nmWavelengthsBlocked500nm500nm475nm&525nmShortPassLongPassBandPass光学系统：滤光片（Filter）荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递到各个PMT(光电倍增管中)FC500的光路——固定光路，互换式滤片矩形反射光路，光路短，能量损失小，易于低强度荧光检测，并且组合滤片能保证荧光检测的特异性完全光学线路免校正客户可自由更换的滤片组合，且无须校正光路，可方便新荧光染料的使用，扩展机器的功能；流式细胞仪的电路进行信号检测和分析荧光信号由光电接收器（PMT）接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图、统计分析光电管和检测系统：PMT光电管和检测系统：放大器基本原则--信号强弱差10倍or需线性关系:使用线性放大器(如散射光,DNA分析)--信号强弱差10倍or需分析弱荧光:使用对数放大器(如荧光)FC500采用20比特的信息量数字化信号采集分析数据数据信息量和检测精度的对应关系3Shapiro,H.PracticalFlowCytometry,4thEd.Page206.*LSB=leastsignificantbit,voltagedifferencebetweenchannelnandchanneln+1.NumberofBits#ofChannelsVoltage/LSB*825639.1mV101,0249.77mV124,0962.44mV1416,384610µV1665,536153µV18262,14438.1µV201,048,5769.54µV224,194,3042.38µV2416,777,216596nVThetableshowstheattributesofanalogtodigitalconverters3.Basedonthenumberofbits,theinputsignal(orvoltage)mustincreasebythisamountinordertoaffectachangeinthechanneldisplayed.FC500SampledataOn20bitFC50010MB/sec光纤传输信号，反应迅速荧光分辨率的解析度更高，细胞分群更好在荧光表达低通道处（100-101阴性细胞位置）不会出现低分辨率数据常见的信号不饱和现象220=1,048,576channels218=262,144channelsSampledataOnother18bitAnalyzerFC500优秀的荧光检测灵敏度和分辨率CAnalyzerNONEsmoothhistogramCD19FITCNOWASHFC500NONEsmoothhistogramCD19FITCNOWASH同一份样本检测，FC500的信噪比更好FC500Flowcytometr的基本结构流路：流动室鞘液sheath样本流sample光路：光源光学收集系统电路：光电倍增管(PMT)、光电二极管、放大器（线性、对数）A/D转换（光信号转换为电信号之后的处理分析道数和电信号的脉冲转换）统计：计算机软件FC500高度自动化人性化的软件系统•Windows™2000系统平台•多用户操作•可以将每天的应用预先设置和安排•FCS3.0文件格式，可以直接打开•多种结果输出形式，完全与OFFICE兼容•多种图形叠加方式•开放式软件，可以在任何电脑上安装使用Quickset——直观的电压调节QuickComp——直观的补偿调节补偿前补偿后FC500丰富的上样系统——高通量标准化自动化32支试管自动上样盘（MCL)独立获取样本简单，自动检测和报告，有利于实验的标准化，减少人为误差每支试管检测前单独震动混匀，有利于均匀获取细胞，结果更准确可靠FC500配套自动化标本处理系统全自动标本处理和溶血系统，灵活搭配，减少人为误差，节省人力和试剂-Q-PREP-TQ-PREP-PREPLUSII标本处理系统上样装置与FC500完全兼容FC500全自动无缝连接的流水线系统•无人值守•标准化操作•杜绝污染•速度快模式一模式二独家的可升级多平台自动上样系统FC500MPL24孔96标准孔和深孔反应板40支试管(12x75mm)可以固定体积上样检测可以减少高通量工作需要的烦杂的取样过程将您的注意力从操作中解放出来，而集中于思路的创新FC500是一款单平台既能96孔板又能40管常用试管上样的流式细胞仪FC500智能化的体现FC500面板LED显示屏能随时自动显示•各色荧光的强弱，•激光开启状态，•上样速度，•鞘液、废液水平FC500特点1根激光5色荧光分析，获取高可信度多色数据2种角度前向散射光检测功能，更准确定位目的细胞,20Bit高分辨电子系统，更精确解读荧光信号3种图形显示及更强大的分析工具：各种2维平面图，三维立体图，独特的PRISM浓缩柱形图，无限制的直方图叠加功能4种进样方式：单一试管，32管自动上样，24/96微孔板，40管自动上样，具有目前最丰富的进样模式55X5ADC正反全矩阵高精度补偿及离线补偿系统，自动化的电压补偿调节功能，强大的批量处理分析功能检测的一般步骤1.设置检测方案（PROTOCOL)2.染色标本（同型对照，补偿管，待测样本）3.同型对照管调电压4.电压不变，补偿管调补偿5.电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果电压调节－利用同型对照：设置背景电压volts增益Gain设定阴性和阳性信号强度的临界点荧光补偿FITCPE受激光照射后FITC和PE分子发射光谱相互干扰荧光补偿的调节F