流式细胞术课件

流式细胞术徐琦副教授新疆医科大学基础医学院免疫学教研室第一节流式细胞术概述流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。BDLSR通过流式细胞仪我们可以得到以下信息-相对细胞大小-相对细胞颗粒密度和内部复杂度-染色过细胞的相对荧光强度细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性基础研究淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究临床研究淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度第二节流式细胞仪工作原理采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。一、工作原理基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机，5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别现代流式细胞仪包括液流系统聚焦细胞以供检测光学系统激发和收集光信号电子系统将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析细胞分选系统由样本和鞘液组成待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。1.液流系统液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处喷嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系统示意图FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）2.光学系统FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光学系统示意图（1）激光光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数OpticalFilters460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50LongpassShortpassBandpass光收集系统：光电倍增管（PMT）流式细胞仪的光信号散射光信号荧光信号(2)散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。侧向角散射（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光——FSCForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser侧向角散射光——SSCSideScatterFALSSensor90LSSensorLaser散射光散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异-通常使用“散点图”来看散射光信号-散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据散点图——DotPlotlysedwholeblood测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器（3）荧光测量荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强双色荧光散点图荧光检测器FreqFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)荧光补偿光谱交叉Emissionwavelength(nm)530580630680730780FITCPEPE-TRPE-CY54colors-simultaneouscollection两色以上荧光分析存在光谱交叉荧光补偿方法所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿调与未调补偿FL1FL2注意！用来调节补偿的FITC、PE抗体必须有明显的阳性信号，否则就不会出现荧光渗漏现像，调节补偿也无从入手。在正式数据采集前要调整好补偿，一旦数据被获取，BD、Coulter仪器无法再改变补偿partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论何时都可重新调节多色荧光补偿调节方法同双色法主要由计算机及其软件组成3.电子系统4.细胞分选系统FluorescenceActivatedCellSorting488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第三节流式细胞术数据显示单参数直方图双参数直方图:点图二维等高图假三维等高图三参数直方图多参数分析直分析方图设门分析:REGION和GATE设置数据显示方式FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少参数由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图单参数直方图细胞相对数量信道(channel)X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式2.二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。二维等高图假三维等高图三参数直方图多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析数据分析设门设定阴性与阳性群体的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门线性门Region设置:区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。D1CD4+/CD3-D2CD4+/CD3+D3CD4-/CD3-D4CD4-/CD3+如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。第四节流式细胞样品制备标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他实验的不同，选用不同的抗凝剂。EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：0.38%肝素：15IU/ml可选的抗凝剂有：标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。样本处理标准试剂：一、10%BovineSerumAlbuminBSA1.溶解10gBSA至100ml蒸馏水中2.4ºC，20000g离心30分钟3.分装后-20ºC保存二、0.1%BSA-PBS缓冲液1.准备500ml，PH7.3PBS2.加入5ml10%BSA3.使用0.45um滤网过滤三、氯化铵溶血剂1.在一升蒸馏水中溶解8.29gNH4CL,1gKHCO3和37mgNa2EDTA2.调节PH值至7.23.在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤方法一：溶血法1.取100ul抗凝全血；2.快速加入2mlNH4CL溶血剂,混匀；3.室温孵育5分钟；4.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；5.4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2mlBSA-PBS；6.4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。收集白细胞方法二：密度离心法提取单个核细胞Histopaque1077为Ficoll与Sodiumdiatrizoate(泛影酸钠)混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。1.准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量），等量PBS稀释；2.准备1mlHistopaque1077(Sigma)；3.室温下700g离心30分钟；4.仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；5.加4mlBSA-PBS，400g离心10分钟；6.加2mlBSA-PBS清洗2次。操作淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。从组织获取淋巴细胞1.将样本置于陪替氏培养皿，加入15mlBSA-PBS；2.将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；3.将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。方法：其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛