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纯化高转染级别的质粒DNA【工作台流程】BENCHPROTOCOL准备工作：1.将RNaseA溶液加入P1缓冲液(BufferP1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-frewater)3.可选：加LyseBlue试剂于BufferP14.检查BufferP2是否有SDS沉淀precipitation有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.BufferP3置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养补充：1.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合2.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA3.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制4.准备1个冰浴盒用于步骤65.准备室温下的异丙醇10.5ml6.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤：peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterialculture,harvest&lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnightLB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水，用1NNaOH调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。可将离心后菌块-20摄氏度下冰冻保存暂时终止实验。2.于10mlBufferP1中重悬浮resuspend细菌沉淀bacterialpellet，混匀必须重悬彻底，涡流振荡器或移液器反复吹打至没有菌块3.加入10mlBufferP2，剧烈vigorously翻转invert4-6次混合，置于incubate室温5min在室温孵化期间准备QIAfilter过滤筒cartridge：在滤筒出水口outlet喷嘴nozzle拧上screw帽子，将滤筒置于管架备用加入bufferP2后不要使用涡流振荡器(以免剪切细菌DNA)，裂解反应不要超过5分钟。bufferP2用完要拧紧盖子以免酸化。4.加10ml预冷的BufferP3，剧烈翻转4-6次混合加入bufferP3后析出绒毛样物质(细菌DNA，蛋白，细胞碎片和KDS)，裂解液粘性下降。如果裂解液仍然粘稠度大，说明混合不够。很重要的是混合好后迅速倒入滤筒，以防止扰动沉淀层。B.细菌裂解清除bacteriallysateclearing5.将裂解液倒入pour滤筒内，置室温(15-25摄氏度)10min，不要套入滤筒活塞plunger！从喷嘴处取掉滤筒的帽子，缓慢轻柔的将活塞插入滤筒并滤过细菌裂解液于50ml试管中在静置的10分钟里不要搅动滤筒内的裂解液。析出物会慢慢上浮于上层。如果过了10分钟析出物未浮在上层，可用消毒的移液器枪尖驱赶滤筒壁上的析出物。取120ul过滤后裂解液样本(Sample1)用于实验后分析胶，确定生长和裂解条件是否最佳。6.加2.5mlBufferER到过滤好的裂解液中，翻转约10次使其混合，冰浴30minC.结合、洗涤和抽提质粒DNAbind,wash&eluteplasmidDNA7.用10mlBufferQBT平衡equilibrateQIAGEN-tip500，并保持重力流动gravityflow排空柱筒emptycolumn8.使用第6步骤得到的过滤裂解液加入QIAGEN-tip柱中使其重力流动通过树脂resin取120ul通过树脂后的裂解液样本(Sample2)用于实验后分析胶，确定质粒DNA结合于树脂的效率。9.2×30mlBufferQC洗涤QIAGEN-tip第一步洗涤质粒准备过程中大多数污染物，第二步洗涤特别针对培养液过多或所用菌种含糖量较多的情况。取240ul洗涤液样本(Sample3)用于实验后分析胶注意：以下步骤均为无内毒素操作，需使用无内毒素的聚丙烯塑料管或预处理的玻璃器皿(消毒后180摄氏度烘箱过夜)10.15mlbufferQN抽提DNA用30ml的无内毒素管子收集。如果质粒DNA大于45-50kb，将抽提缓冲液QN65摄氏度预热后使用会提高产量取60ul洗提样本(Sample4)用于实验后分析胶可将洗提液存于4摄氏度保存以暂停实验，但时间不宜过夜。D.沉淀、洗涤和再溶解质粒DNAprecipitate,wash&redissolveplasmidDNA11.加入10.5ml室温异丙醇(isopropanol)到抽提的DNA中并混合。4摄氏度冰冻离心机=15,000×g，30min离心，小心的去上清dacantthesupernatant尽管离心在4摄氏度离心机下以防止样本过热，但所有溶液须为室温以减少盐沉淀。离心前可在离心管上标记以明确离心后DNA斑块的位置。12.用5ml70％室温的去内毒素乙醇(去内毒素水中加入40ml96-100％乙醇)洗涤DNA沉淀，=15,000×g，10min离心。小心去上清避免扰动沉淀13.空气中干燥air-dry沉淀5-10min，重新溶解DNA到适量的去内毒素的BufferTE中。冲洗管壁以完全重新溶解所有DNA(特别是用玻璃管的话)。但不要用移液器吹打以免剪切DNA。过于干燥的DNA斑块很难重新溶解。酸性环境有助于DNA溶解。E.产量测定14.260nm紫外分光光度计：A2600.1-1.0之间琼脂糖凝胶电泳15.如果产量很低则将前述Sample用于电泳分析问题所在。