分子生物学实验指导

分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。因局部实验失败而没有取得预期的结果，无法进入下一步实验的小组，先要与教师讨论分析失败的原因，然后向其他成功组的同学或教师索取实验材料继续进行。内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验指导分子生物学实验注意事项………………………………………………………………………1实验一质粒DNA的小量制备…………………………………………………………….…2实验二质粒DNA电泳鉴定………………………………………………………………….5实验三质粒DNA的酶切………………………………………………………………….…8实验四PCR扩增制备目的基因……………………………………………………………...10实验五从琼脂糖凝胶中回收DNA片断.……..……………………………………………13实验六目的基因片段与载体连接……………….…………………………………………16实验七感受态大肠杆菌的制备…………………………………………………………..18实验八感受态细菌的转化…………………………………………………………………..20实验九转化克隆的筛选和鉴定……………………………………………………………..22实验十外源基因的诱导表达……………………………………………………………….26实验十一SDS-PAGE检测表达蛋白……………………………………………………….28附录附录1：表达载体pET-Trx的相关资料……………………………………………………..32附录2：从NIH查阅的nattokinase（纳豆激酶）序列之一.………………………………33附录3：DNA和蛋白质分子量Marker……………………………………………………..34附录4：本实验所用的克隆载体图…………………………………………………………..34附录5：分子生物学大实验进度表（参考）…………………………………………………..35附录6：实验流程参考图……………………………………………………………………..36附录7：开题报告格式………………………………………………………………………...37附录8：实验论文参考格式…………………………………………………………………...41内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验指导分子生物学实验注意事项1.上实验课的学生每两人分为一个小组，登记领取微量移液器（1000L,200L和10L各一支）。2.课前要提前预习实验内容，弄懂实验设计的目的，理清实验顺序。认真填写《本科分子生物学实验论文开题报告》，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。3.实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应根据整体实验方案制定自己的实验顺序和计划。4.实验指导中所写的实验操作技术和步骤仅供参考，学生在弄懂操作原理和目的的基础上多动脑筋，摸索适合自己的操作技巧。5.由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排，分别记录实验操作和结果。6.实验指导中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，全部实验必须在10天之内完成。7.每一步实验都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！8.对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是PCR仪、微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。9.写作《开题报告》、《实验记录》和《实验论文》一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作错误和结果失败）。10.在实验室内不能大声喧哗。11.在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放和处理。12.实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。13.值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。14.实验时损坏的任何物品都要及时申报，并按照生命科学学院实验中心的有关规定进行适当的赔偿。15.实验需要的油性记号笔、计时器（或手表）、卫生纸、白大衣、擦手毛巾等需要自备。内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验指导实验一质粒DNA的小量制备【实验目的】学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。【实验原理】根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，DNA双螺旋结构被解开而变性。尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去，质粒DNA和小分子RNA留在上清液里，用乙醇沉淀即可得到质粒DNA。【实验用品】1.器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，恒温摇床，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机，pH计，制冰机。摇菌试管洗净并盖上盖、1.5mL离心管装入不锈钢饭盒、吸头（10L，200L，1000L）装入相应的吸头盒，一起高压（121C20min）灭菌。2.试剂（1）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200L5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121C20min灭菌。使用时加入氨苄青霉素，终浓度100g/mL。（2）氨苄青霉素储存液：无菌水配制100mg/mL，分装后-20C保存。（3）溶液I[葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液]：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTA，调pH8.0（4）溶液II（NaOH/SDS溶液)：0.2mol/LNaOH，1%SDS，现用现配（5）溶液III[KAc溶液（pH4.8）]：60mL5mol/LKAc，加冰乙酸调至pH4.8，补ddwater至100mL（6）10mg/mLRNaseA：RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中（7）TE缓冲液：10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0，高温高压灭菌内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验指导（8）95%和70%乙醇（9）0.5mol/LEDTApH8.0：称取18.61gNa2EDTA·2H2O，加入约80mL的去离子水，充分搅拌。用NaOH颗粒调节PH值至8.0（约2gNaOH）使其完全溶解。加去离子水将溶液定容至100mL。高温高压灭菌。（10）1mol/LTrisHClpH7.5：称取12.1gTris碱,加80mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH6.8（约加6.5mL）。让溶液冷却至室温，调至pH7.5，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4C保存（11）1mol/LTrisHClpH8.0：称取12.1gTris碱,加80mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.0（约加4.2mL）。让溶液冷却至室温，调至pH8.0，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4C保存3.材料带有pET-Trx质粒载体的DH5菌,带有pMD18-T-NK（纳豆激酶）载体的DH5菌，保存在-80C。【实验方法】1.在超净工作台中分别吸取5mL和2mLLB（Amp+），分别加入两支灭菌的摇菌管中。2.从超低温冰箱中取出保存pET-Trx载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种，在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/mL氨苄青霉素）中搅拌一下，操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！37C摇床中摇过夜。pET-Trx菌：接种于5mLLB（Amp+）pMD18-T-NK菌：接种于2mLLB（Amp+）3.取1.5mL的菌液于1.5mL离心管中，10000r/min离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。pET-Trx菌：3管（3×1.5mL）pMD18-T-NK菌：1管（1.5mL）4.在沉淀中加入100L溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置1～5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的碎冰块备用。）5.加入200L溶液II，盖上盖后上下轻微颠倒几次混匀，插入冰中，放置1～5min。6.加入150L溶液III，盖上盖后上下轻微颠倒几次混匀，插入冰中，放置1～5min。7.14000r/min离心5～10min，小心吸取400L上清液于另一个干净的1.5mL离心管中，（不要将白色沉淀物带入！如带入可重新离心），加入800L95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下（或冰上）静置5～10min。内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验指导8.14000r/min离心10min，小心弃掉上清液，加入500L70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。14000r/min离心10min，小心弃掉上清液，在卫生纸上倒置轻磕，尽量弃干净。9.再加入500L70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。14000r/min离心10min，小心弃掉上清液，在卫生纸亦上倒置轻磕，尽量弃干净。10.离心管倒置在37C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。11.pMD18-T-NK加入30L无菌蒸馏水或TE缓冲液；3管pET-Trx质粒中每管加入10L蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下（约2000r/min1min），使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-Trx质粒中加入1LRNaesA。用油性记号笔标记后放入4C冰箱中备用。12.在剩余的菌液中倒入少许84消毒液