单克隆抗体药物概述

单克隆抗体药物概述高熹（2015级交流学院生物技术168615140001）摘要：单克隆抗体药物作为一种具有独特优势的生物靶向药物，具有特异性高、靶向性强和毒副作用低的特点，在治疗方面效果显著。伴随着抗体技术的不断发展以及新型抗体的不断出现，单克隆抗体药物已成为制药业发展最快的领域之一，目前正在研究的生物技术药物中有四分之一都是单克隆抗体药物，期间又涌现出了各种单抗衍生物，包括抗体药物偶联物、小分子抗体、双特异性抗体等。本文就单克隆抗体药物的分类、制备、应用和发展等进行综述。关键词：单克隆抗体药物；抗体技术；单抗衍生物1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。杂交瘤技术为规模化生产特异性高、结构和性质均一稳定的单克隆抗体提空了有力的保障。1单克隆抗体药物的发展和现状1986年，FDA批准了第一个鼠源单克隆抗体药物Muromonab-CD3上市，用于预防肾移植时急性器官排斥。单克隆抗体药物的发展因人抗鼠抗体反应在1988年到1993年间陷入低谷。之后随着重组DNA技术的发展，各种抗体人缘化技术迅速发展，单克隆抗体药物经历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段。随后出现的噬菌体展示文库技术和转基因小鼠技术，使全人源单抗的产生成为可能。过去的30年抗体工程的研究主要集中于减弱鼠源抗体的免疫原性和提高产生抗体的能力，如今全人源抗体已成为治疗性单抗的主流，2002年第一个全人源抗体阿达木单抗上市。且随着微生物和哺乳动物细胞等外源蛋白表达系统的技术进步和表达水平的提高，使治疗性单克隆抗体在临床和商业上都取得了巨大的成功。尽管如此，单克隆抗体药物的发展仍然存在许多挑战。迄今为止，大多数FDA批准上市的单抗药物都是未经修饰的全长抗体，这是相对分子质量在150×103左右的大蛋白分子，这些抗体药物在临床应用取得巨大成功的同时，本身的局限性也得到越来越多的关注[1]。现如今，单抗药物经历了市场和时间的考验，已经成为生物医药的最重要组成部分，在疾病治疗上具有广阔的应用前景，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。治疗性单抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶点决定，上市和在研的单抗药物有些靶向相同的靶点，有些有自己独特的作用靶点，新的作用靶点也在不断地出现。随着研究深入、技术进步，单抗药物呈现出旺盛的发展势头[2]。随着已上市品种的销售额不断增长以及新适应症的批准和新品种的上市，单克隆抗体药物市场容量迅速攀升。1997-2007年是全球单抗产业增长的爆发期，十年间CAGR高达58.6%。2008年-2015年，全球单抗产业增速放缓明显，CAGR降至14.8%，但仍要显著高于全球医药行业约5%的增速水平。1997年全球单抗药物销售额仅3.7亿美元，2015年全球单抗药物的销售额已超过980亿美元。1992-2015年间，国外共批准上市了61个原研抗体药，其中后有6个退市。在现有上市的55个产品（49个单抗产品，6个具有抗体功能的受体-Fc融合蛋白）中，51个是由美国或欧盟首先批准上市的，数量占比高达92.7%，生产企业方面：罗氏、诺华等10家欧美企业共开发和生产了全球70%以上的抗体药物，欧美国家在全球抗体产业中居于绝对主导地位。2015年全球最畅销药物TOP10中有5个单抗，分别是阿达木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗，它们占据了单抗药物的半壁江山，销售额约为426.6亿美元，约占2015年全球单克隆抗体药物总销售额的44%。根据预测，2016-2020年，全球单抗产业仍将以9.84%的RAGR快速发展（同期全球药品市场CAGR约为5%），2020年市场规模有望突破1300亿美元。相比处于上升期的国外单抗产业，我国单抗产业仍处于初创期，单抗药物仍以仿制为主，单抗药物无论产品种类和销售规模都远低于欧美发达国家，并且进口单抗药物占据了主要市场。2015年中国单抗药物市场容量约为70多亿元人民币，约80%的市场被外资制药企业占据。在单抗药物领域，国内制药企业面临市场快速增长和进口替代的双重机遇。单克隆抗体研究已被列入863计划和国家重点攻关项目。十三五期间，生物产业将是国家重点支持的战略性新兴产业。单抗药物的研究、开发和市场应用必将吸引一大批制药企业的参与和布局。目前全国有100多家企业在做单抗，除了中信国健、百泰生物、海正药业等一些老牌企业之外，近几年还涌现出了很多新兴企业，包括丽珠单抗、信达生物等。在2016三生制药集团媒体开放日活动上，三生制药集团董事长娄竞博士表示三生制药集团的3万升生产线建成后将成为中国规模最大的单克隆抗体生产线，也是从细胞系、培养基、原液到制剂（多种剂型和规格）的全球最完整生产线之一。2单克隆抗体药物分类根据来源的不同.单克隆抗体大体可分为4类,即鼠源化单克隆抗体、人鼠嵌合体单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人源化单克隆抗体[3]，这也是单克隆抗体发展的四个重要的阶段。2.1鼠源化单克隆抗体人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。2.1.1体内法体内法即腹水法。尽管腹水中抗体浓度比较高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必须达到SPF级,繁殖、饲养BALB/c小鼠及生产腹水、纯化抗体的厂房必须符合GMP要求,WHO及我国对体内法生产的人用鼠源单克隆抗体的质检项目繁多,要求严格,因此限制了体内法在人用鼠源单抗生产领域的应用。2.1.2体外法体外法(杂交瘤细胞体外培养法)的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,因此是人用鼠源单抗生产方式的主要发展方向[4]。体外法的制备流程也基本相同，即从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞，待细胞融合后，对单个细胞进行克隆，体外培养出能分泌单抗的克隆细胞。但鼠源单抗在临床应用方面存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）较弱，而且它与补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体分子质量较大,在人血循环中的半衰期短，在体内穿透血管的能力较差;它发挥ADCC作用的时间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易引起宿主过敏反应[5]，产生人抗鼠抗体(HAMAs)，将其清除出体外，因此限制了它的应用。2.2人鼠嵌合单克隆抗体抗体分子由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，具有典型的功能区结构，其与抗原的结合完全取决于氨基端的可变区。恒定区与抗体抗原结合无关，并且恒定区是抗体分子免疫原性的主要部位，因此可通过用人的恒定区取代鼠单抗的恒定区进行人源化，消除其大部分异源性，并能保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力，这种方法得益于DNA重组技术的发展。1984年首次应用上述方法重组制备了抗半抗原磷酸胆碱的全分子人鼠嵌合抗体[6]。嵌合抗体可将同一个可变区与不同类别的恒定区链接在一起，比较在相同特异性情况下不同类别的功能。其制备过程主要包括了可变区的克隆，表达载体的构建及嵌合抗体的表达。可变区基因的克隆在早期主要从杂交瘤细胞的基因组文库中克隆出来带有完整上游转录调控序列的轻重链可变基因DNA片段，组装到含有人恒定区的表达载体中。PCR方法的建立和发展为抗体可变区基因的克隆提供了简便有效的方法。接着将控制小鼠抗体重链和轻链中可变区的基因片段与人抗体重链及轻链的不变区的基因片段在体外链接形成重组基因，然后导入真核细胞的某种表达质粒中，再将这种含有重组基因的表达载体转化哺乳动物骨髓瘤细胞，筛选能分泌完整抗体的转化子。但嵌合抗体仍保留着30%左右的鼠源序列，并且其常达不到预期的效果。嵌合抗体目前主要有3种应用形式：嵌合免疫球蛋白G、嵌合Fab和嵌合,F（ab’）2。嵌合免疫球蛋白G因含有人抗体的Fc段，能介导补体及细胞对靶抗原的杀伤和吞噬作用，但因鼠源性成分较多，免疫原性大且组织穿透力差[7]；嵌合Fab和嵌合F（ab’）2抗体分子小、穿透力强，可充当小分子载体用于放射免疫显像及放射免疫治疗。2.3人源化单克隆抗体由于鼠源抗体的可变区仍残留一定的免疫原性人缘化单克隆抗体又较嵌合抗体有所改进。由于鼠源性抗体可变区中的骨架区仍残留一定的免疫原性，为了最大限度地减少鼠源成分，用人骨架区替代鼠骨架区可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了CDR是鼠源以外，其余全部是人源结构。这一类型的抗体被称为CDR移植抗体或改型抗体，包括完全CDR移植抗体、部分CDR移植抗体和特异决定区（SDR）移植抗体[8]。2.3.1完全CDR移植抗体完全CDR移植抗体由于鼠源性抗体VR中的骨架区仍残留一定的免疫原性，为最大限度的减少鼠源成分，用人FR替代鼠FR可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了３个CDR是鼠源以外，其余全部是人源结构，这一类型的抗体称为CDR移植抗体或改型抗体。应用这一策略，将鼠源McAb的CDR区完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗体。但随后多项研究发现，简单的CDR移植往往明显降低抗原－抗体反应的亲和力，甚至丧失与抗原结合的能力。其原因在于FR不仅作为骨架对CDR起到支持作用，FR中的某些非CDR区补充调控残基还为CDR的回折构象提供必要的支持，其形状和侧链大小协同决定CDR的基本结构，影响CDR与抗原结合的特异性和亲和力[9-10]。2.3.2部分CDR移植抗体在简单CDR移植的基础上又相继发展了部分CDR移植技术。研究发现轻链的CDR1、CDR2和重链的CDR3对保证抗体与抗原特异性结合至关重要，其余三个CDR的作用则较低[11]。因此只将抗体结合抗原必须的CDR移植到人抗体的FR骨架上即能获得对人免疫原性更小的嵌合抗体，这类抗体称为部分CDR移植抗体。2.3.3特异决定区移植抗体正如并非所有的CDR在抗原抗体反应中具有同样的重要作用，X射线晶体衍射实验提示具体到一个CDR中,不是所有的蛋白分子都参与抗原的特异性识别。执行抗原识别的CDR中的一些特定区域称为SDR。由此又产生了SDR移植抗体。该抗体是将McAb中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基移植到人抗体的相关部位，从而进一步提高抗体的人源化水平。根据目前的研究，抗体轻链的SDR多位于27d、34、50、55、89、96位残基，而重链的SDR多位于31、35b、50、58、95、101位残基[12]。基于上述两种策略，部分CDR移植、SDR移植的构建方法主要有：（1）模板替换，使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR；（2）表面重塑，对鼠CDR和FR表面残基进行镶饰或重塑，使其具有类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的形式；（3）补偿变换，对起关键作用的残基进行改变以补偿完全的CDR移植；（4）定位保留，人源化McAb以人FR保守序列为模板，但保留了鼠源McAbVR中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR和FR中的一些关键残基。2.4全人源单克隆抗体由于免疫原性的存在，人们一直在努力制备全人源化的单克隆抗体，目前主要有抗体库技术和人源性抗体转基因小鼠技术两种。2.4.1抗体库技术抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免疫，从理论上讲，106-108的库容就可能包容所有的抗体。利用抗原即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选到针对该物种自身抗原的抗体。从人的抗体库中可以得到完全是人源的McAb，克服了难以用杂交瘤技术获得人源McAb的障碍。此外，由于细菌细胞增殖快，