分子生物学RNA的生物合成(转录)

1第十一章RNA的生物合成（转录）RNABiosynthesis（Transcription）2转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。此过程把DNA的碱基序列转抄成RNA。3A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制A-U，T-A，G-CA-T，G-C配对mRNA，tRNA，rRNA子代双链DNA（半保留复制）产物RNA聚合酶（RNA-pol）DNA聚合酶酶NTPdNTP原料模板链转录（不对称转录）两股链均复制模板转录复制4参与转录的物质原料:NTP模板:DNA酶:RNA聚合酶RNApolymerase,RNA-pol其他蛋白质因子5第一节模板和酶TemplatesandEnzymes6一、转录模板•DNA分子上能转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。•DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作信息链、转录链、有意义链或Watson链。•相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为非转录链、反义链或Crick链。模板、转录及翻译产物5′······GCAGTACATGTC······3′编码链3′······CGTCATGTACAG······5′模板链DNA转录mRNA5′······GCAGUACAUGUC······3′翻译peptideN······Ala·Val·His·Val······C7不对称转录(asymmetrictranscription)•转录对DNA链的选择性称为不对称转录。•有两方面的含义：–在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；–模板链并非永远在同一条单链上。不对称转录结构基因结构基因有意义链有意义链转录产物及方向转录产物及方向structuralgenestructuralgene：：可以转录出可以转录出RNARNA的的DNADNA区段区段8二、RNA聚合酶（一）原核生物的RNA聚合酶目前研究比较透彻的是E.coli的RNA聚合酶。其它原核生物的RNA聚合酶在结构、组成、功能上都与E.coli的RNA聚合酶相似。所有原核生物RNA聚合酶都受利福平或利福霉素抑制。核心酶(coreenzyme)催化转录延长全酶(holoenzyme)活细胞转录起始需要大肠杆菌大肠杆菌RNARNA聚合酶的组分聚合酶的组分36512决定哪些基因被转录150618催化功能155613结合DNA模板70263辨认起始点亚基分子量功能由四种亚基（ααββ′σ）组成的五聚体蛋白质分子量480kDa910（二）真核生物的RNA聚合酶•已发现三种RNA聚合酶分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，专一性地转录不同的基因，生成不同的产物i。•鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶的特异性抑制剂，但敏感性不同。真核生物真核生物RNARNA聚合酶分子组成聚合酶分子组成•真核生物的转录酶由8-12个亚基组成；•电泳分析显示：–有些亚基是两种酶或者三种酶共有的。•共有的亚基分子量低于40kDa。–每种酶有两个分子量＞100kDa的大亚基作催化亚基，功能上与原核生物RNA-pol的β、β′亚基对应，结构上也有同源性。–分子量接近50kDa的亚基则与原核生物α亚基相似。•也可能存在类似原核的σ亚基组分。11三、模板上酶的辨认、结合•原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。结构基因调控序列操纵子：转录单位或转录区段启动子RNA-Pol•RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。12对启动子的研究方法RNA-Pol保护法•1）分离某段基因并与纯RNA-pol混合；•2）加入核酸外切酶（胰DNA酶）水解DNA；•3）分离被RNA聚合酶结合而未被水解的基因片段；•4）测定并分析保护区（40-60bp）的碱基序列；原核生物启动子保守序列5′3′RNA-pol酶保护区酶保护区结构基因结构基因终止点终止点酶保护区DNA放大5′3′--5050--4040--3030--2020--100+10100+10TTGACATTGACAAACTGTAACTGTpppG转录开始HH22NN翻译开始翻译开始TATAAT-PuATATTA-PyPribnowboxRNA-pol保护区结构特征这些研究表明：受保护的DNA区域位于结构基因上游，约40——60bp长度（40bp相当于约14nm，4个螺距）的DNA片段，结构上有一致性；大肠杆菌及噬茵体DNA的启动子有两个A-T配对比较集中的区域：在mRNA开始点（第一核苷酸位置为+1）前的10个碱基对左右，有一致性序列为TATAAT（Pribnowbox）。此序列是识别信号的关键部分。另一识别部位距mRNA起始点前约35bp处，可能与RNA聚合酶的开始结合有关。一致性序列为TTGACA。序列分析还证明起始密码子在转录起始点下游，说明翻译起始点在转录起始点之后。RNA-Pol结合-10区v较结合-35区相对牢固。推论：-35区是RNA-Pol对转录起始的辨认点（recognitionsite）；辨认结合后酶向下游移动，达到Pribnowbox，酶已经跨入转录起始点，形成相对稳定的酶-DNA复合物，就可以开始转录。RNARNA聚合酶保护法聚合酶保护法13RNA-pol的移动14真核生物启动子保守序列15第二节转录过程TheProcessofTranscription16一、原核生物的转录过程•（一）转录起始•就是RNA-Pol结合到DNA模板上的起始区域，DNA双链局部解开，一条链作模板面加入第一个、第二个NTP，RNA-Pol催化形成第一个磷酸二酯键。•转录起始复合物形成。•RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH35-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi两个核苷酸形成磷酸二酯键17（二）转录延长•亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi181、转录空泡•RNA-Pol（核心酶）-DNA-RNA形成的转录复合物–RNA聚合酶可以覆盖40bp以上长度的DNA–转录解链范围小于20bp–杂化双链长度约12bpNMP逐个加入遇到模板为A时加入的是U不是TRNA-Pol向下游移动时RNA分子的5′pppG······的结构仍然保留192、原核生物转录过程中的羽毛状现象20（三）转录终止•指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。1.依赖Rho因子的转录终止依赖Rho终止转录的RNA产物3′末端含有丰富的C（红色标出部分），或者有规律地出现C碱基。Rho可以结合此区段发挥ATP酶和解螺旋酶的作用。原核细胞转录终止因子ρ，是由六个亚基构成的蛋白质，分子量64kD。（1）ρ具有结合RNA的能力：对polyC的结合力最强。（2）ρ还有ATP酶和解螺旋酶的活性。当转录产物的3′末端含有丰富的C（或有规律地出现）时，就会与ρ结合使二者都发生构象的变化，从而使RNA聚合酶停顿。解螺旋酶活性使DNA-RNA杂化链分开释放RNA产物，转录终止。分类1、依赖Rho(ρ)因子的转录终止2、非依赖Rho因子的转录终止2.非依赖Rho因子的转录终止•DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。•茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构。–举例：•大肠杆菌色氨酸操纵子•大肠杆菌核蛋白体蛋白基因E.coli色氨酸操纵子转录终止信号区的碱基顺序终止子：DNA模板上的终止信号或终止序列。终止子的转录产物RNA可以形成特殊茎-环结构（发夹）终止转录。终止信号区的结构特点:终止信号前的富含GC区后总有富含AT区跟随。最突出的特点是它的富含GC区有二重对称性(反转重复序列），使该区域的转录产物有自身互补性，能形成茎环（stemloop）或发夹（hairpin）状结构，使RNA-pol脱落。茎环结构使转录终止的机理•使RNA聚合酶变构，转录停顿；•使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。1）RNA茎环结构的形成，可以改变RNA-pol的构象及其与DNA模板的结合方式，造成酶不再向下游移动，出现转录停顿与终止。2）转录复合物上局部存在的DNA-RNA杂化双链由于RNA自身的局部双链（茎环）和DNA部分子回复双螺旋而变短，杂化双链变的不稳定，转录复合物趋于解体。3）DNA模板中富含AT区域的一系列碱基所决定的末端连续的寡聚U促进RNA链从模板脱落。因为所有的碱基配对中rU：dA最不稳定。212.非依赖Rho因子的转录终止•DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。•茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构。–举例：•大肠杆菌核蛋白体蛋白基因•大肠杆菌色氨酸操纵子茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构大肠杆菌rpl-L基因3′末端碱基序列及其转录产物的二级结构茎环结构使转录终止的机理•使RNA聚合酶变构，转录停顿；•使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。1）RNA茎环结构的形成，可以改变RNA-pol的构象及其与DNA模板的结合方式，造成酶不再向下游移动，出现转录停顿与终止。2）转录复合物上局部存在的DNA-RNA杂化双链由于RNA自身的局部双链（茎环）和DNA部分子回复双螺旋而变短，杂化双链变的不稳定，转录复合物趋于解体。3）DNA模板中富含AT区域的一系列碱基所决定的末端连续的寡聚U促进RNA链从模板脱落。因为所有的碱基配对中rU：dA最不稳定。22二、真核生物的转录起始（一）转录起始•真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。•转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。典型的RNA-polⅡ转录的基因1、转录起始前的上游区段2.转录因子•能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。•反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。233.转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC)•真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。ⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化转录的PICⅡHⅡETFⅡF2个亚基组成：大亚基有解螺旋酶活性小亚基与原核生物σ因子同源。244.模板理论(piecingtheory)•拼板理论认为：•一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。•转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，•再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。25（二）转录延长•RNA-pol前移处处都遇上核小体，二者大小差别不大。•转录延长过程中可以观察到核小体移位（仅见于试管内转录）和解聚现象。转录延长中的核小体移位真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。26（三）真核生物的转录终止•真核生物转录终止和转录后修饰密切相关。–1．真核生物DNA上有转录终止的信号，称为转录终止的修饰点。•已知真核生物DNA读码框架的3′端均含富含AT的序列（如AATAAA或ATTAAA等）；•相隔0-30bp后又出现TTTT顺序（通常是3-5个T）；–该结构可能与转录终止及3′端加polyA有关。–2．转录越过转录修饰点后的RNA在修饰点被切断，随即“加尾”、“戴帽”。–余下RN