第四章-荧光分析法

仪器分析第四章荧光分析法学习目的通过学习荧光分析法的基本原理、荧光分光光度计构造及荧光分析的新技术等内容，达到熟悉荧光分析法在药物分析中应用的目的。学习要点激发光谱、荧光光谱；产生荧光的条件；荧光强度的影响因素；荧光法分析条件的选择；荧光法的定量依据及适用条件。目录第一节荧光分析法的基本原理第二节荧光分光光度计第三节荧光分析法分析条件的选择第四节荧光分析法的应用一、荧光发现16世纪人们观察到当用紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质就会发出不同强度和不同颜色的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念。概述二、分子发光的类型1、按激发的模式分类：2、按分子激发态的类型分类：分子发光光致发光化学发光热致发光场致发光分子发光荧光磷光三、荧光分析法的特点1、灵敏度高2、选择性强3、工作曲线线性范围宽一、分子荧光的产生二、激发光谱与荧光光谱三、荧光与分子结构的关系四、影响荧光强度的外部因素第一节荧光分析法的基本原理（一）分子中电子能级的多重性（二）荧光的产生1、振动弛豫2、内部能量转换3、荧光发射4、外部能量转换5、体系间跨越6、磷光发射一、分子荧光的产生电子的多重态是一种电子的运动状态，用M=2s+1表示，s为各电子自旋量子数的代数和其值为0或1。若分子中所有电子都是自旋配对的，则s=0，M=1，该分子处于单重态，用S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。（一）分子中电子能级的多重性电子激发态的多重态M=2S+1基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，仍然是M=1，分子处于激发的多重态，用S*表示。若电子在跃迁过程中伴随自旋方向的变化，分子中便具有两个自旋不配对的电子，s=1，M=3，分子处于激发的三重态，用T1*表示。S*与T1*的区别在于电子自旋方向不同，T1*能级较S*稍低一些。（一）分子中电子能级的多重性电子激发态的多重态M=2S+1S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生处于激发态的分子是不稳定的，它可通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式释放多余能量而返回基态。辐射跃迁主要涉及荧光、延迟荧光、磷光发射。无辐射跃迁指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部能量转换、体系间跨越、外部能量转换。（二）荧光的产生传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间跨越振动弛豫无辐射跃迁1、荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长λ′2的荧光。2、磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）。S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生3、振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。4、内转换：同多重态电子能级中，等能级间的无辐射能级交换的过程。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生5、外转换：激发分子与溶剂或其他溶质分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。6、系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生（一）激发光谱与荧光光谱（二）荧光光谱特征二、激发光谱与荧光光谱荧光强度：指发射荧光的光的强度。荧光强度F与荧光物质浓度c，激发光强度I0的关系为F=φfI0(1-10-εbc)其中φf为荧光量子产率，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度。该式表明荧光强度与量子产率成正比，但与荧光物质浓度没有直线关系。稀溶液时，上式简化为F=2.3φfI0εbc=Kc此时，荧光强度与荧光物质浓度成正比。（一）激发光谱与荧光光谱1、激发光谱曲线（F−λex曲线）固定荧光的发射波长(即测定波长),改变入射光波长,得到荧光(磷光)强度与入射光波长的关系曲线。2、荧光光谱（F−λem曲线）固定激发光波长(入射光波长),改变荧光的测定波长(发射波长),得到荧光强度与发射光波长关系曲线。（一）激发光谱与荧光光谱硫酸奎宁的激发光谱（a）及荧光光谱（b）1、Stokes位移指相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱中最强波长间的差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，由于振动弛豫等原因消耗了能量。（二）荧光光谱特征2、荧光光谱的形状与激发波长无关一般情况下，用不同波长的激发光来激发荧光分子，得到的荧光发射光谱的形状基本相同。原因：荧光均由第一激发态的最低振动能级返回基态产生的。不同激发波长下维生素B2荧光光谱图（二）荧光光谱特征3、荧光光谱与激发光谱成镜像关系激发光谱与荧光光谱形状相似，存在“镜像对称”关系。200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱（二）荧光光谱特征200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱（二）荧光光谱特征（一）荧光效率（二）荧光寿命（三）分子结构与荧光的关系三、荧光与分子结构的关系荧光效率也叫荧光量子产率,指物质发射荧光的量子数与所吸收的激发光量子数的比值，用φf表示：荧光素钠在水中φf=0.92；在乙醇中蒽φf=0.30、菲φf=0.10。荧光效率低的物质，虽有强紫外吸收，但没有荧光发射。f发射的荧光量子数吸收的激发光量子数化合物f0.110.290.460.600.52（一）荧光效率指除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，用τf表示。F0为激发时的荧光强度，Ft为激发后时间t的荧光强度，以ln(F0/Ft)对t作直线，直线的斜率即为1/τf。0tflnFtF＝（二）荧光寿命分子产生荧光必须具备的条件：（1）强的紫外-可见吸收；（2）具有一定的荧光量子产率。分子结构对荧光起决定作用。1、共轭结构2、分子的刚性平面结构3、取代基效应（三）分子结构与荧光的关系1、共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽λex(max)(nm)205286365λem(max)(nm)278321404F0.110.290.46（三）分子结构与荧光的关系2、刚性平面结构荧光物质的刚性和平面性增加，荧光效率越大，荧光波长发生长移。芴联二苯F=1.0F=0.2红色荧光弱荧光（三）分子结构与荧光的关系Mg2+萘维生素A8-羟基喹啉3、取代基效应（1）给电子取代基加强荧光如：—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN（2）吸电子取代基减弱荧光如：—C=O，—COOH，—NO2（3）与电子共轭体系作用较小的取代基，对荧光影响不明显。如：—SO3H，—NH3+，—R（三）分子结构与荧光的关系（一）溶剂的影响（二）温度的影响（三）pH值的影响（四）散射光的影响（五）荧光熄灭剂的影响四、影响荧光强度的外部因素1、溶剂的极性：对许多共轭芳族化合物，激发时发生了→*跃迁，其激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂极性的增大，激发态比基态能量下降的更多，荧光光谱向长波移动。2、氢键溶剂形成氢键的能力增大，荧光光谱向短波移动。3、溶剂黏度介质黏度的提高，将减小激发态分子振动和转动的速率，同时降低与其他溶质分子的碰撞概率，有利于提高荧光或磷光的强度。（一）溶剂的影响温度上升，将使激发态分子的振动驰豫和内转化作用加剧，同时增大了发光分子与溶剂分子碰撞失活的机会，将导致溶液荧光和磷光效率和强度下降。荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，每降低10℃，φf增加3%，在-80℃时，φf为1。（二）温度的影响对酸碱型荧光物质，在不同的溶液pH下，荧光物质的存在形式不同，因而具有不同的荧光。（三）pH值的影响散射光分为瑞利光和拉曼光。瑞利光：指光子和物质分子相碰撞时，不发生能量的交换，光子的频率并未改变，只是光子运动方向发生改变的散射光。拉曼光：指光子和物质分子相碰撞时，有部分光子和物质分子发生非弹性碰撞，在光子运动方向发生改变同时，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量的交换，光子频率发生改变的散射光。（四）色散光的影响散射光对荧光测定有干扰，选择适当的激发波长可消除。（四）色散光的影响1、荧光熄灭（荧光淬灭）指荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。2、荧光熄灭剂指能与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。3、荧光熄灭类型(1)碰撞淬灭；(2)生成化合物的淬灭(静态淬灭)；(3)能量转移淬灭；(4)氧的淬灭；(5)转入三重态的淬灭；(6)浓度过大引起的自淬灭。（五）荧光熄灭剂的影响一、荧光分光光度计（一）光源（二）单色器（三）样品池（四）检测器（五）信号显示记录器二、荧光分析新技术简介（一）同步荧光分析法（二）三维荧光分析法（三）时间分辨荧光分析法第二节荧光分光光度计一、荧光分光光度计光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器（一）光源氙灯，发射强度大，250nm~700nm范围内的连续光谱，300~400nm波段内的谱线强度几乎相等。（二）单色器两个光栅单色器。激发单色器置于样品池前，用于选择激发光的波长；发射单色器置于样品池和检测器间，用于选择荧光发射波长，并消除其他杂散光的干扰。一、荧光分光光度计（三）样品池通常用低荧光的石英材料制成，四面均为磨光透明面，厚度1cm。问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么异同？（1）样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样。（2）吸收池的形状：紫外-可见分光光度计吸收池两面透光，荧光分光光度计样品池四面透光。（3）使用注意事项：波长范围、容易破碎、沾污问题。一、荧光分光光度计（四）检测器光电倍增管，电感耦合器件（CCD）。放大倍数：2n~5n（n=10），103~107，最大108~109（五）信号显示记录器计算机光谱工作站，对数字信号进行采集、处理、显示，并对各系统进行自动控制。一、荧光分光光度计（一）同步荧光分析法（二）三维荧光分析法（三）时间分辨荧光分析法二、荧光分析新技术该法同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长构成光谱图。有如下方式：①固定波长差同步扫描法。②固定能量差同步扫描法。③可变波长（可变角）同步扫描法。（一）同步荧光分析法①固定波长差同步扫描法。3种芬芳族化合物p-terphenyl、anthracene和perylene混合。在一个固定的激发光下，发射光扫描(蓝色曲线)不能显示混合物中的组成。20nm间隔的同步扫描(黑色曲线)在3种物质各自发射光值最大时，显示出3段明显的波峰。（一）同步荧光分析法②固定能量差同步扫描法。③可变波长（可变角）同步扫描法。（一）同步荧光分析法特点：简化谱图，减小了谱图重复现象和散射光的影响，提高选择性；但损失了其它光谱带，提供的信息量减少。适合多组分混合物的分析，可应用于不同基因的分型、正常细胞与肿瘤细胞的区分等。（一）同步荧光分析法该法描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化关系的谱图，能提供比常规荧光光谱和倒数荧光光谱更完整的光谱信息。可用于某些癌细胞的荧光代谢物的检测，以区分癌细胞与非癌细胞。（二）三维荧光分析法利用稀土配合