药物作用靶点100914

生命科学研究新进展系列讲座药物作用靶点与天然药物筛选李海航,Ph.D华南师范大学生命科学学院[e-mail]内容一.前言(我国药物行业存在的问题简介)二.药物靶,靶点或靶标三.药物靶标的发现四.基于靶标的药物设计五.靶点药物开发概况六.基于靶标的天然药物七.多靶点药物的开发八.重要疾病的靶点药物九.天然药物提取分离与靶点药物筛选研究我国药物研究与开发•生命科学各领域中最薄弱,最落后,面临危机•西药：到目前为止只有开发了半个(青蒿素)或一个半自主药物•中医药：最古老，也最落后•缺乏系统的药物研究与开发体系•急功近利,投机取巧,夸大吹嘘等成风,”研发”了大量无用新药,无用新药批文•中国工程院医药卫生学部院士秦伯益:“国家投入大幅度增长、新药苗头不断涌现,可成果寥寥无几,有国际影响的创新药一个都没有。”•49年以来,我国自主研发、有国际影响的“新药”仅两个,50年代合成的二巯基丁二酸钠和60年代开发的青蒿素。60年代至今,无一原创药诞生。•我国每年都有上百新药被注册,而美国、英国一年难出几例新药中国工程院医药卫生学部院士秦伯益原创药研发中存在三大误区误区一，对基因组药物学期盼过早。盲目追求时髦的新概念2000年《自然》杂志对人类基因组研究现状与展望的评述第一阶段:2000年测定全部DNA序列；第二阶段:2010年识别所有基因；第三阶段:2050年确定所有基因功能；第四阶段:2100年确定基因变异与疾病关系”不少所谓专家学者“正根据基因变异设计药物”,短期内根本不可能.误区二，对中医药开发潜力指望太高。死守传统和古老的概念“中医药发展靠不断研究，而不是过头的舆论宣传”。“中华民族的繁衍生息靠的是中医药”、“西医治病、中医治本”、“西药有毒副作用，中药没有毒副作用”、“西医对疑难杂症没有办法，中医有办法”。过高指望中医不实际。“不少检查、治疗手段需要西医，中医不能相比。”误区三，传统的新药研发途径过时了。传统新药研发途径包括:经验积累、偶然机遇、药物普筛、综合筛选、天然物提取、定向合成、代谢与药理研究、毒副作用、老药新用等。现在新药研发的团队都想“一口气吃个胖娃娃”、“跨越发展”,不符合发展规律。很多研究人员都没有“蹲下去找靶点调研。我国药物创新和研发存在的问题中和药业•1．研发经费不足。全国药物研发总投入少于美国的辉瑞公司。•2．技术水平有限,研发团队建设不力。药物行业是技术密集型行业。没有几个企业真正投入技术力量研发新药,无研发部门或研发部门转行。国外药企研发人员占从业员30%,我国不到4%,且大多从事技术型改造。•3．主流研发机构与药企合作不成熟。研究机构重文章,企业重市场。•4.宏观政策影响大,缺乏总体规划,高税收和逐年降价使企业濒临停产。•5.知识产权问题日益突出。外国药企纷纷加大在中国的知识产权保护。在国外上市的新药中几乎不可能有新药供国内药企仿制。美国、日本、欧盟批准的新药在化合物专利、制备工艺专利、适应症专利、用法用量专利都获得相应的保护。我国药品市场现状及存在的问题•我国医药业年均增长17%,在36个行业中排第18-20位,总值占GDP的3.2%.•1）制售假劣药行为屡禁不止。生产和销售假劣药的范围和规模不断扩大。•2）药品虚假广告铺天盖地。夸大疗效被药企奉为营销宝典,违法率达95%。•3）药品购销不规范,商业贿赂严重,回扣风行。行贿受贿已是公开的秘密。药品在流通过程中价格翻十几倍,造成药价过高。研发好药不如搞定几家医院!•4）无证经营和超范围经营,买卖、出租、出借许可证等屡禁不止。•5）零售药店和生产企业不规范。80%以上购药者会向药店销售员咨询,大多数最后采纳其意见选药。但药店销售人员70%以上未经正规医药知识培训。销售员为“厂家提成”而向顾客推荐高价药。一些药企取得GMP等认证后,为节约成本和迅速获利而降低生产条件和管理。药物研究与开发是我国最有发展潜力的行业之一药物开发途径的变化传统的药物筛选途径化合物→组织,细胞,动物→分子(作用靶)→人体现代药物筛选途径分子(作用靶)→化合物→细胞,组织,动物,人体靶点药物与靶向治疗手术靶向给药:穿刺给药,手术局部给药,脏器动脉/血管给药,靶点/标药物(主动靶向)靶向给药(被动靶向)局部给药:膏药,局部用散剂,眼膏,眼药水,宫内给药,栓剂,肠溶剂,长效缓释剂或前体药物:微球,微囊,脂质体,磁性微球,细胞载体,药物-大分子/配体/单克隆抗体结合物我国研究:脂质体,药物-糖蛋白/单克隆抗体结合物,蛋白质等各种天然与合成物相结合物的微球,肝/脑靶向前体药等存在的问题:工艺复杂,载药量少,稳定性差,制剂,体内代谢,评价与标准,体内生理作用等.大量生产尚有不少问题.药物与病变细胞特定部位或特定分子结合来实现药物的作用。大多是与特定细胞或蛋白有特异反应的分子或分子基团,如抗体、单抗、蛋白受体、激素类等。二.药靶(DrugTargets)1药靶的定义:存在于组织细胞内,与疾病发生有因果关系或参与疾病发展,与药物相互作用,并可通过药物对其进行调节而实现治疗目的的特定生物分子2药靶的条件:与疾病相关,有适当的化学特性和亲和力结合小分子物,在病变细胞或组织中表达,在细胞培养体系中可通过调节靶标活性产生特定效应,在动物模型中再现,药物在人体内有效。3.药靶的化学成分:绝大多数(98%以上)为蛋白质。50%以上属G蛋白耦联受体,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶,锌金属肽酶,丝氨酸蛋白酶,核激素受体及磷酸二酯酶等6个家族。4.药靶的意义:药物发现从依赖动物筛选逐渐转变到“一病一靶”。是高通量药物筛选及其模型建立的基础.5.最成的例:胆固醇合成抑制剂HMG(3-羟基-3甲基戊二酸单酰)辅酶A还原酶为靶点的选择性抑制剂,已有系列他汀类降脂药物,全球销售量最大药,最有效降胆固醇药.三.药靶的发现靶点的发现主要通过基因,蛋白质和药物三个方面.1.基因水平上的靶点发现1)人类遗传学,生物信息学,表达图谱,代谢途径分析,基因芯片,mRNA差异显示,消减杂交等,结合表型变化发现大量候选靶标.(重要和关键基因)2)宿主和病原菌或正常细胞与病理细胞之间的基因差异表达和基因序列分析,找出疾病相关基因.3)疾病相关基因(靶基因)功能分析,包括基因敲除,过量表达,RNA干扰,反义mRNA和核酶抑制及计算机模拟基因产物结构和功能分析,确认药物靶点.2.以蛋白质组学为基础发现药物靶标人体内可能的药靶约3000～15000个,目前发现的不到500个,多数药靶是蛋白质,如酶、受体、激素。1)差异蛋白质:差异蛋白组学法比较疾病和正常状态蛋白表达差异,找可能药靶.•常用技术:蛋白质芯片,二维凝胶电泳,同位素亲和标签,双向荧光差异凝胶电泳等技术及它们和质谱鉴定的结合。•应用较多的:二维凝胶电泳和质谱分析。急性淋巴细胞白血病中的高表达多肽Op18有磷酸化和非磷酸化两种形式,抑制Op18及其表达或磷酸化能有效抑制肿瘤细胞增殖,有望以Op18为靶开发药物。2)蛋白质相互作用:蛋白质与蛋白质相互作用。常用方法:有酵母双杂交,噬菌体展示,表面等离子共振,串联亲和纯化和双分子荧光互补等。酵母双杂交是发现药靶的重要途径。通过报告基因表达产物可敏感地检测蛋白质之间相互作用路径及药物干扰阻止其相互作用以达到治疗疾病的目的。3.药物分子为探针发现药物靶标1)“药钓靶”与“靶钓药”:生物分子相互作用分析。用药物单分子作为探针,跟踪监测它与蛋白质分子之间的相互作用来发现药靶。配体垂钓:将药物分子探针固定在传感器芯片表面,将与之相互作用的分子(如配体蛋白质)溶液流过芯片表面,检测溶液中分子与芯片表面分子结合和解离的整个过程,称作“配体垂钓”。亲和层析:固定药物分子筛选靶点,或固定靶点来筛选药物分子。2)计算机模拟:以药物为探针,计算机模拟药物与蛋白质三维结构及其相互作用,找出能与其特定结合的蛋白或潜在药靶。3)药物作用前后基因和蛋白质表达的改变,找出可能的药靶。如:用基因芯片研究苦参碱诱导白血病K562细胞基因表达谱,发现CCNB1,cyclinD1,PCNA等基因表达显著改变,可能是苦参碱作用靶点。四.基于靶标的药物设计利用配体-靶标复合物三维结构信息设计新药,基本过程:①确定药物作用靶标(如蛋白质、核酸等);②对靶标进行分离纯化;③确定靶标三维结构,提出系列假定配体与靶分子复合物的三维结构;④依据这些结构信息,利用相关计算机程序进行配体分子设计,模拟出最佳配体结构模型;⑤合成模拟结构物,测试活性。若满意可进入前临床实验.重复以上过程,直至满意为止.需要的条件:X射线衍射和核磁共振(NMR)等结构研究手段,研究靶蛋白分子结构,计算机辅助的靶蛋白结构模型建立和药物设计。如治疗艾滋病的安瑞那韦(amprenavir,Agenerase)和奈非那韦(nelfinavir,viracept)就是用HIV蛋白酶的晶体结构开发的药物.药物研发需要生物学,化学,电脑物理,仪器分析等多个领域合作五.靶点药物开发概况•现代药物开发是基于特定靶寻找先导化合物,进而筛选候选药物的过程。•人类基因组研究结果预测:有600种小分子靶点,1800多蛋白质靶点,及2100种基因治疗和siRNA治疗靶点。•失败教训:近20年对高选择性靶点的集中研发,候选新药经临床试验后成功上市的比例不但没有增加，反而不断下降。新靶标药物研发的失败率不断增加。对药物研发思路产生了极大的挑战.•FDA1989-2000年批准的361个新分子实体药物,仅6%是基于新药物靶点。因此,制药公司纷纷调整研发模式:新靶标药物研发,已有靶标药物研发,me-too类改良药物以及部分生物仿制药研发等。•经典“可药性”靶点：酶、G-蛋白偶联受体和核激素受体等。这些靶点的药理机制较明确,开发经验较成熟,成功率高。•有开发潜力的靶:同源序列少(不超过5个),参与的调节路径少(不超过2个),分布的主要组织少(不超过2个),靶标的开发潜力/前景较好。1.上市药物的靶标数量•Drews等(1997)粗略推定为483个分子药物靶标。•Hopkins和Groom(2002)根据药物起效的5条原则,目前药物仅通过120个靶标起主要作用。•Golden(2003):所有上市药物对应了273种蛋白。•Imming(2006)等对药物靶标作了明确界定,认为药物靶标是一种能够与化学试剂特异结合并产生临床疗效的分子结构。不包括药理学和生物化学研究工具以及相关技术。得出的结论：目前的分子药物靶点数目为218个。•Overington等(2006)提出有价值的评估:药物数量减至1357种。所有药物通过324个靶标起作用,其中266个为人类基因衍生的,其余为病原体靶标。•小分子药物作用于248种蛋白,其中207个靶标由人体基因组编码;口服小分子药物靶标227个,其中186个为人类基因靶标。•OveringtonJP,Al-LazikanIB,Hopkinsal.Howmanydrugtargetsarethere?NatRevDrugDiscov,2006,5(12):993-996.2.上市药物靶点的类别•生物化学分类:上市小分子和生化药靶点,50%以上属4个关键生化类别:G-蛋白偶联受体(26.8%),核受体(13%),配体门控性离子通道(7.9%)及电压门控离子通道(5.5%)。其他包括青霉素结合蛋白,髓过氧化酶,神经递质,DNA拓扑异构酶,纤维结合蛋白,细胞色素P450等。•生物结构位点:细胞膜表面(60%),细胞质(16%),细胞核(10%),胞外分泌(8%),线粒体(3%),内质网(2%),过氧化酶体(1%)。约1/3的靶点是膜本身•疾病领域分布:268个上市药物靶点,依次是肿瘤,传染病和寄生虫病,神经系统,感觉器官病及循环系统疾病等。这些疾病都有代表性靶点药物•化学分类:肿瘤和抗感染领域的主要药物靶点是酶。中枢神经系统和循环系统疾病通常靶向G-蛋白偶联受体、离子通道或载体等。•不同化学特征药物所靶向的靶点:合成药物通常靶向G-蛋白偶联受体、酶、离子通道和载体等。天然产物主要靶向N-末端重复序列,而生物制品(