药物分析中常用仪器分析技术

第二章药物分析中常用仪器分析技术第一节折光率与比旋光度折光率折射率折射率又叫折光率，它是有机化合物的重要物理常数之一，折光率的数值可以作为液体纯度的标志。基本原理当光线自一种透明介质进入另一种透明介质时，由于两种介质的密度不同，光的进行速度发生变化，从而使传播方向发生改变，这种现象叫做折射现象，它遵从折射定律。折射定律折射率是入射角的正弦与折射角的正弦的比值。n=sini/sinrn—折光率sini—光线的入射角的正弦sinr—折射角的正弦折光率(ntλ)《中国药典》规定采用钠光D线测定供试品相对于空气的折光率，除另有规定外，供试品的温度应为20℃，由此测得的折光率记为n20D。测定方法折光率一般使用阿贝折光仪测定。阿贝折光仪使用日光作为光源，镜筒中安装的消色棱镜可使不同波长的折射光均集中于钠光D线的位置而达到目镜。折光仪在使用前应用校正用棱镜或水进行校正。比旋光度基本原理平面偏振光通过某些光学活性物质的液体或者溶液时，偏振光的振动平面向左或向右旋转，这种现象叫旋光现象。偏振光旋转的角度称为旋光度。比旋度偏振光透过长1dm且每1ml含旋光物质1g的溶液，在一定的波长和温度下测得的旋光度称为比旋度。温度为20℃，使用钠光的D线作光源条件下测定的比旋度记为[α]20D。比旋度计算方法液体供试品：[α]20D=α/(ld)固体供试品：[α]20D=100α/（Cl）[α]20D—比旋度α—测得的旋光度l—测定管长度（dm）d—液体的相对密度C—供试品溶液的浓度（g/100ml）旋光度的测定方法将测定管用供试液体或固体物质的溶液冲洗数次，缓缓注入供试液体或溶液适量，置于旋光计内检测读数，既得供试溶液的旋光度。用同法读取旋光度3次，取3次的平均数，既得测定的旋光度值。比旋度的应用1、比旋度的测定2、在杂质检查中的应用3、在含量测定中的应用第二节紫外-可见分光光度法相关定义光是电磁波，不同波长的光具有不同的能量。物质吸收紫外和可见光区的电磁波而产生的吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。利用紫外-可见吸收光谱进行定性和定量分析的方法称为紫外-可见分光光度法。基本原理分子的价电子吸收了光的能量，由低能量的基态转变为高能量的激发态的过程称为跃迁。产生跃迁的必要条件是光子所提供的能量正好与跃迁所需的能量相当，紫外光和可见光所具有的能量，恰好能满足电子在不同电子能级之间的跃迁。利用紫外-可见吸收光谱定性分析不同结构的物质分子能级差不同，可以产生不同的紫外-可见吸收光谱，据此可以对物质进行定性分析。利用紫外-可见吸收光谱定量分析郎伯-比尔定律：A=-lgT=-lgI/I0=ECLA—吸收度T—透光率E—吸收系数C—被测物质溶液的浓度L—光路长度E与C的关系C（“mol/L”）—E（摩尔吸收系数，ε）C（“g/100ml”）—E（百分吸收系数，E1%1cm）紫外分光光度计光源单色器吸收池检测器数据记录和处理紫外-可见分光光谱的应用1、在鉴别中的应用（1）对比吸收光谱特征参数；（2）比较吸收度比值的一致性；（3）对比吸收光谱的一致性。2、在杂质检查中的应用3、在含量测定中的应用（1）对照品比较法；（2）吸收系数法；（3）计算分光光度法。对照品比较法Cx=（Ax/AR）CRCx—供试品溶液的浓度CR—对照品溶液的浓度Ax—供试品溶液的吸收度AR—对照品溶液的吸收度吸收系数法C=A/（E1%1cm·L）计算分光光度法将分光光度法测得的吸收度进行适当的数学处理，以获得供试品中待测物质的量，如：双波长分光光度法、导数光谱法等。计算分光光度法主要用于消除样品中干扰组分的干扰。第三节红外吸收光谱法相关定义物质分子吸收波数位于4000~400cm-1范围的红外光而产生的吸收光谱称为红外吸收光谱。利用红外吸收光谱对物质进行分析的方法称为红外分光光度法（缩写为IR）。基本原理红外光谱是由分子的振动、转动能级引起的光谱。振动过程中，若分子的偶极矩发生变化，则相应的振动称为红外活性振动，红外活性振动产生吸收峰。没有偶极矩变化的振动称为红外非活性振动，红外非活性振动不产生吸收峰。红外吸收光谱连续改变辐射红外光的波数，记录红外光的透光率，就得到了物质的红外吸收光谱；红外吸收光谱又称分子的振-转光谱。不同分子具有不同的振动、转动形式和能级，因而具有不同的红外吸收光谱，据此可进行物质的定性分析。红外光谱图一张红外光谱图按其特征大致分为特征区和指纹区。特征区的吸收峰由一些常见的基团或化学键的振动产生，具有峰位恒定、峰相对稀疏、易于辨认和归属的特点。指纹区内的峰，来源多，既有化学键的伸缩振动吸收、弯曲振动吸收，又有泛頻峰等弱吸收，这些峰峰位集中，强度变化大，不易归属，但对特定化合物，该区域具有人指纹一样的特征性。红外光谱仪光源吸收池单色器检测器数据记录和处理红外光谱应用1、在鉴别中的应用2、在检查中的应用第四节气相色谱分析法相关定义色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。它先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此是分析混合物最有力的手段。色谱法具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用广泛等优点。色谱法分类1、按流动相与固定相的分子聚集状态分类：（1）气相色谱法、液相色谱法（2）气-固色谱法、气-液色谱法液-固色谱法、液-液色谱法2、按操作形式分类：柱色谱法、平面色谱法、电泳法等3、按分离机制分类：分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法空间排阻色谱法及亲和色谱法气相色谱法以气体为流动相的色谱法称为气相色谱法（简称GC）。气相色谱法具有分离效能高、灵敏度高、样品用量少、分析速度快等优点，但受样品蒸汽压限制，不适用于难挥发和热稳定性差的物质的分析。气相色谱法基本原理样品中各组分在固定相与载气间分配，由于各组分的分配系数不等，它们将按分配系数大小的顺序依次被载气带出色谱柱。分配系数小的组分先流出，分配系数大的后流出。气相色谱法相关概念和术语1、基线：当没有组分进入检测器是，色谱流出曲线是一条只反映仪器噪声随时间变化的曲线，称为基线。2、色谱图和色谱峰：色谱响应信号随时间的变化曲线称为色谱图。流出曲线上的突起部分称为色谱峰。3、保留值：是用来描述各组分色谱峰在色谱图中的位置。色谱峰正常色谱峰：对称型正态分布曲线。不正常色谱峰：前伸峰、拖尾峰和分叉峰。色谱峰相关参数峰高（h）：指峰顶到基线的距离。峰面积（A）：指每个组分的流出曲线与基线间所包围的面积。峰宽：指色谱峰两侧拐点处所作的切线与峰底相交两点之间的距离。在峰高1/2处的峰宽称为半峰宽（W1/2）。保留值相关概念（1）死时间（tM）：从进样开始到惰性组分从柱中流出，呈现浓度极大值所需要的时间。（2）保留时间（tR）：从进样开始到某个组分色谱峰顶点的时间间隔称为该组分的保留时间。（3）调整保留时间（t’R）：扣除死时间后的保留时间。（4）死体积（VM）：色谱柱在填充后柱管内固定相颗粒间所剩余的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。（5）保留体积（VR）：流动相携带样品进入色谱柱，从进样开始到柱后某个样品组分出现浓度极大值时，所通过流动相的体积。（6）调整保留体积（V’R）：指扣除死体积后的保留体积。（7）保留指数（I）：用以表示化合物在一定温度下在某种固定液上的相对保留值。塔板理论塔板理论是把色谱柱看作一个分馏塔，在每个塔板内，样品在气液两相中达到分配平衡，经过多次的分配平衡后，分配系数小的组分先到达塔顶。由于色谱柱的塔板相当多，因此分配系数有微小的差别即可实现分离。塔板理论的假设实际上是把组分在两相间的连续性转移过程，分解为间歇的在单个塔板中的分配平衡过程，也就是用分离过程的分解动作来说明色谱过程。塔板理论相关方程理论塔板数、半峰宽和保留时间的关系：n=5.54（tR/W1/2）2理论塔板高度可由柱长和理论塔板数计算：H=L/n气相色谱仪气源进样及汽化系统色谱柱和柱温箱检测器气相色谱仪检测器检测器类型：1、热导检测器（TCD）2、电子捕获检测器（ECD）3、氢焰离子化检测器（FID）检测器性能的要求：1、灵敏度高；2、稳定性好，噪音低；3、线性范围宽；4、死体积小，响应快。气相色谱的应用1、在鉴别中的应用2、在检查中的应用3、在含量测定中的应用：气相色谱在检查中的应用（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质的含量：按规定，精密称（量）取对照品和内标物质配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器中，记录色谱图，按下式计算校正因子：校正因子（f）=（As/Cs）/（AR/CR）As-内标物质的峰面积或峰高、AR-对照品的峰面积或峰高Cs-内标物质的浓度、CR-对照品的浓度再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，按下式计算含量：含量（Cx）=fAx/（As/Cs）Ax-供试品中待测成分或某个杂质的峰面积或峰高Cx-供试品中待测成分或某个杂质的浓度气相色谱在检查中的应用（2）外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量：按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图。测量对照品和供试品待测成分的峰面积或峰高，按下式计算含量：含量（Cx）=CR（Ax/AR）气相色谱在检查中的应用（3）加校正因子的主成分自身对照法：按规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按（1）法计算杂质的校正因子。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器的灵敏度或进样量，然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。气相色谱在检查中的应用（4）不加校正因子和主成分自身对照法：当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法，按照（3）中方法配制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。气相色谱在检查中的应用（5）面积归一化法：测定各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积占总峰面积的百分率，应符合规定。由于峰面积归一化法误差较大，因此，通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。气相色谱在含量测定中的应用（1）外标法：根据峰面积与测定组分的量成正比计算含量的方法。（2）内标法：选定一内标物质，加入待测样品溶液中，根据待测样品和内标溶液响应信号的比值与待测样品的浓度成正比的关系来定量。对内标物质的要求是：1、必须是原样品中不含有的组分；2、其保留时间与待测组分相近，但是能完全分离；3、必须是纯度合乎要求的纯物质；第五节高效液相色谱法高效液相色谱法分类1、吸附色谱法：固定相为固体吸附剂的高效液相色谱法。2、分配色谱法：流动相和固定相是互不相溶的两种液体，组分在两相间分配，因分配系数不同而被分离的高效液相色谱法。（1）正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称正相色谱法。（2）反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称反相色谱法。（3）反相离子对色谱法：是把离子对试剂加入极性流动相中，被分析离子在流动相中与离子对试剂生成不带电荷的中性离子对，从而增加在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增大，改善分离效果。（4）离子抑制色谱法：是通过调整流动相的PH值，抑制组分的解离，增加它在非极性固定相中的溶解度。高效液相色谱法中常用固定相1、硅胶：表孔硅胶、无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶、堆积硅珠2、化学键合相：通过化学反应将固定液的官能团合在载体表面，所形成的填料称为化学键合相，简称键合相。（1）非极性键合相：用于反相色谱。（2）极性键合相：用于正相色谱和反相色谱。3、键合型离子交换剂：以全多孔球形硅胶或无定形硅胶为基体，其表面分别键合所需的离子交换基团。高效液相色谱仪组成高压输液泵色谱柱