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实验动物设计大纲实验名称：普通小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型比较课题来源：自选设计班级：****级**本科**班设计人员：****************设计日期：****年**月**日成都医学院实验技术教研室2010年制一、立题依据（一）目的与意义比较研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特点,建立理想动物模型,为研究发病机理和防治措施奠定基础。（二）国内外研究现状人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,RSV)是全球婴幼儿下呼吸道感染首位病毒病原体,几乎所有儿童两岁前感染过至少一次RSV[1],年龄越小病情越重,再感染率高,与哮喘发生密切相关[2]。免疫缺陷者更易感染,临床症状更为严重,常致死亡[3]。每年住院治疗的50%-75%婴幼儿毛细支气管炎和25%~40%的肺炎是RSV直接引起,1岁内婴儿RSV感染率68.8%,1-2岁感染率达82.6%~100%。婴儿期急性RSV下呼吸道感染使非特应体质和特应体质儿童发生哮喘危险性都比普通儿童明显增加,是哮喘的独立危险因素[4]虽然已有许多抗RSV制剂和疫苗的研究,但尚无安全有效的防治方法。抗RSV制剂的研究需要建立理想的动物模型,但目前已建立的系列感染模型均不够满意。肺组织RSV抗原保护性免疫仅能维持数月,福尔马林灭活疫苗不能起到保护作用反而加重病情,至今RSV仍无安全有效的治疗药物和预防疫苗,脱氧核酶等新型抗RSV制剂正在研究中,已在体外无细胞体系和细胞模型中表现抗病毒活性,需要建立恰当的动物模型,进一步在体内研究其抗病毒作用[5]。从RSV发现至今,已建立的黑猩猩、猕猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有优势和局限[6],除灵长类动物可出现临床症状,其他都是无症状隐性感染[7]。BALB/c小鼠为近交繁殖产生，其对多种病原体具有易感性，利用小鼠建立模型的优点是它易获得,遗传背景清楚而均一,基因改造技术成熟,已有多种商品化试剂,是目前应用最广泛的实验动物。但小鼠不是RSV自然宿主,我们以往实验发现BALB/c鼠感染RSV没有临床症状,肺内病毒复制水平相对低,病毒滴度下降快,带毒时间短,限制了治疗效果的观察[8]。裸小鼠采用nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠交配方法产生，这种无毛小鼠是由于第11号染色体等位基因突变引起的，裸小鼠主要特征是无毛、裸体和无胸腺，缺乏成熟T细胞的免疫功能，B淋巴细胞正常，成年裸小鼠较普通小鼠有较高水平的NK细胞活性，目前未做过裸小鼠RSV感染模型，对其优势和局限尚不完全清楚。（三）存在的问题目前虽然已有许多抗RSV制剂和疫苗的研究,但尚无安全有效的防治方法，RSV感染具体发病机制也不够清楚，其发病机制和抗RSV制剂的研究需要建立理想的动物模型,但目前已建立的系列感染模型均不够满意。（四）解决问题的思路复制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型，不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况,免疫荧光和免疫组化检测RSV抗原,光镜和电镜检查肺组织病理学改变，比较研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特点。参考文献：[1]BlackCP.SystematicReviewoftheBiologyandMedicalManagementofRespiratorySyncytialVirusInfection[J].RespiratoryCare,2003;48(3):209-233.[2]HoltPC,S1yPD.InteractionsbetweenRSVinfection,asthmaandatopy:unravelingthecomplexities[J].JExpMed,2002;196(10):1271-1275.[3]MeissnerHC,RennelsMB,PickeringLK,etal.Riskofsevererespiratorysyncytialvirusdisease,identificationofhighriskinfantsandrecommendationsforprophylaxiswithpalivizumab[J].PediatrInfectDisJ,2004;23(3):284-285.[4]OddywH,deMerkNH,S1yPD,eta1.Theeffectsofrespiratoryinfections,atopyandbreastfeedingonchildhoodasthma[J].EurRespirJ,2002;19(5):899-905.[5]ZhaoC-A,ZhaoX-D,YuH-Getal.InhibitionofrespiratorysyncytialvirusreplicationinculturedcellsbyRNAcleavingDNAzyme[J].ChinJPediatr,2003;41(8):594-598.[6]SchmidtAC,JohnsonTR,PeterJM,etal.Respiratorysyncytialvirusandotherpneumoviruses:areviewoftheinternationalsymposium-RSV2003[J].VirusResearch,2004;106:1-13.[7]McArthur-VaughanK,GershwinLJ.Arhesusmonkeymodelofrespiratorysyncytialvirusinfection[J].JMedPrimatol,2002;31(2):61-73.[8]LianG-L,YuH-G,ZhaoX-D,etal.Establishmentofrespiratorysyncytialvirusinfectionmodelinmice[J].JXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences),2003;24(4):329-332.二、实验设计方案（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标：比较研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特点,以建立理想动物模型拟解决的关键问题：BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的复制，对试验性RSV感染的模型进行分组与实验结果分析。（二）实验设计1、实验动物设计（1）遗传背景BALB/c鼠遗传背景：近交系BALB/c小鼠裸小鼠遗传背景：采用nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠交配方法产生的同源导入近交系小鼠（2）微生物质量控制BALB/c小鼠微生物质量要求：普通级动物要求。裸小鼠微生物质量要求：SPF（无特定病原体）或无菌要求（3）育种繁殖BALB/c小鼠育种繁殖：繁殖方法：近交繁殖初始动物的选择：挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹性别鉴定：1、雄鼠的生殖器距肛门较远2、雄鼠生殖器与肛门之间长毛3、雄鼠的生殖器较雌鼠大4、雌鼠乳头较雄鼠明显性成熟期：35-55日龄；实配年龄：60日龄左右；成熟时体重：20克以上发情鉴定：动情期小鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象配种：动情前期交配交配形式：采用全同胞兄妹交配形式妊娠诊断：摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法育种代数：作为亲本的全同胞兄妹（初始动物）记为0代，按雌雄1：1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1：1进行交配，以此类推，直到20代以上个体选择：选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因保种方法：平行线系统扩大繁殖生产方法：交通信号灯方法裸小鼠育种繁殖:繁殖方法：近交繁殖（同源导入近交）初始动物的选择：挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹性别鉴定：1、雄鼠的生殖器距肛门较远2、雄鼠的生殖器较雌鼠大3、雌鼠乳头较雄鼠明显发情鉴定：动情期小鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象配种：动情前期交配交配形式：采用nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠交配方法，雌雄比例为1：1，有时可采用1：2或1：3妊娠诊断：摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法（平均每胎所得纯合子仔鼠能占仔数的55．0％，离乳率97％，1—4胎生育恒定，一年存活率达100％，最长生存期可达752d。）育种代数：作为亲本nu／+雌鼠与nu／nu雄鼠记为0代，按雌雄1：1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1：1进行交配，以此类推，直到20代以上个体选择：选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因保种方法：平行线系统扩大繁殖生产方法：交通信号灯方法（4）饲养管理BALB/c小鼠饲养管理:BALB/c小鼠环境标准：实验动物饲养室的温度为18-19℃，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lxBALB/c小鼠设施：开放系统BALB/c小鼠笼器具：采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，垫料须经高压蒸汽灭菌BALB/c小鼠饲喂：饲喂小鼠全价营养颗粒饲料，饲料的消毒灭菌应达到相应等级小鼠微生物控制的要求。饲喂采取“少量勤添”的原则，每周喂料3-4次，饮水应保证连续不断，每周换水2-3次，垫料每周更换1-2次BALB/c小鼠饲养环境卫生消毒：做好室内的清洁、消毒、及饲料笼器具的清洗消毒，每次饲养完后，用苯扎溴铵擦拭笼架、地板，每月定期彻底喷雾消毒1次裸小鼠饲养管理:裸小鼠环境标准：实验动物饲养室的温度为18-19℃，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lx，空气洁净度为100000级裸小鼠设施：屏障系统或隔离系统裸小鼠笼器具：采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，一般所有的笼具、垫料、饲料、饮水等都得经过灭菌消毒裸小鼠饲喂：每周饲喂全价营养饲料2—3次。饲料、饮水、垫料及鼠笼均用双层包布包装高压蒸汽灭菌消毒。进室前经缓冲室紫外灯照射后去除外层包布，才能进入繁殖室及实验室裸小鼠饲养环境卫生消毒：繁殖室设在空气过滤十万级环境中放置层流柜作为裸小鼠繁殖饲养条件。启用前，先用2％新洁而灭全面擦拭，然后按消毒区域的容积用高锰酸钾15g，In2加福尔马林15mL混和熏蒸。最后经紫外灯照射，细菌培养阴性才使用。启用后我们的常规消毒是：进实验室前后紫外灯照射30rain，每2周用2％新洁而灭擦拭墙壁、天花板，每一个月用过氧乙酸喷射消毒。每三个月用甲醛和高锰酸甲熏蒸一次(用备用实验室轮流消毒和使用)。每三个月将层流柜的过滤材料拆下进行清洗。每年更换一次过滤材料。饲养人员定期入繁殖室进行饲养管理操作。进室前需淋浴并用新洁而灭常规泡手、消毒、穿无菌衣、带袜的无菌裤、戴口罩、帽子。外层穿上手术隔离衣，并带手术胶手套及无菌纱手套。每次操作完毕，用新洁而灭抹台面及地面。常规每周换两次笼具，投放34d的饲料与饮水。每周加两次鸡蛋和瓜子及一次维生素。2、实验专业设计选用BALB/c鼠和裸小鼠作为实验动物，感染RSV后不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况,免疫荧光和免疫组化检测RSV抗原,光镜和电镜检查肺组织病理学改变3、实验统计设计结果用均数±标准差表示,两两组间比较用t检验,各组间比较用方差分析。α=0.05,P0.05认为有显著性差异。4、实验方法设计(1)实验技术路线(2)实验技术方法1）随机抽样：选正常成年健康体重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分别将30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于小鼠编号下。具体方法：两种动物编号为1—30号，30只BALB/c小鼠按照能被3除的规律：不余到A组，余1到B组，余2到C组；30只