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Normally,weusedfollowingprimerstoamplifybacterial16SrRNAgenes(27Fand1492Rpair)andsequencingthem(usingotherprimers).Theprimersequencsarealllistedinthereference:-LaneDJ(1991)16S/23SrRNAsequencing.In:StackebrandtE,GoodfellowM(eds)Nucleicacidtechniquesinbacterialsystematics.Wiley,Chichester,pp115-17527F5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'PCRandsequencing,mosteubacteria357F5'CTCCTACGGGAGGCAGCAG3'Mosteubacteria530F5'GTGCCAGCMGCCGCGG3'Mosteubacteriaandarchaebacteria926F5'AAACTYAAAKGAATTGACGG3'Mosteubacteriaandarchaebacteria1114F5'GCAACGAGCGCAACCC3'Mosteubacteria342R5'CTGCTGCSYCCCGTAG3'Mosteubacteria519R5'GWATTACCGCGGCKGCTG3'Mosteubacteriaandarchaebacteria907R5'CCGTCAATTCMTTTRAGTTT3'Mosteubacteriaandarchaebacteria1100R5'GGGTTGCGCTCGTTG3'Mosteubacteria1492R5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'PCRandsequencing,mosteubacteria1525R5'AAGGAGGTGWTCCARCC3'PCRandsequencing,mosteubacteriaM=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G,S=G:C.W=A:T;all1:1Anyprimer'sreversecomplementsequenceisitsreversprime.Forexample:519R5'GWATTACCGCGGCKGCTG3'then519F3'CWTAATGGCGCCGKCGAC5'Hopethiswouldusefultoyouandansweredyourquestion.Andhopethiswouldusefultomanyotherpeople.GoodLUCK,guys!以16SrRNA基因为靶基因设计或比较通用引物，用blast效果不太好。因为该基因含有很多高度保守区（9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的，文献或设计的primers往往都能扩增出几乎所有的真细菌，因此，blast时会得到很多同源序列，尽管如此，还是有更多的序列或细菌被省略了。我设计或验证该UP时，是有目的地根据实验需要，从genebank中确定一些常见细菌的属，每个属选几个菌种，每个菌种选2-3个菌株，但一定要包括标准株（可参考文献），然后用MEGLINE进行序列，并与UP进行比较。设计完成后在拿UP与随意查的其他细菌进行比较验证。尽管需要分析的序列可能达近百个，可现在的计算机内存和速度，及宽带都很大，应该是很快的。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。16SrRNA(16SrDNA)寡核苷酸的序列分析首先，16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16SrRNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。分离菌株16SrRNA基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞,加入100μL无菌重蒸H2O中,旋涡混匀后,沸水浴2min,12000rmin-1离心5min,上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR扩增。分离菌株16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定的一般步骤为：16SrRNA基因的PCR引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。扩增反应体积50mL，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行29个循环，PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行。取5mL反应液在10gL-1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR产物测序可由专门技术公司完成。测序得到分离菌株16SrDNA部分序列，此序列一般以*.f.seq形式保存，可以用写字板或Editsequence软件打开，将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析()，具体步骤如下：点击网站中NucleotideBLAST下Nucleotide-nucleotideBLAST[blastn]选项，将测序所得序列粘贴在“search”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“blast”，然后点击“format”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断16SrDNA鉴定结果。遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAStar软件包中的MegAlign程序计算样本间的遗传距离。由GenBank中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入Clustalx1.8程序进行DNA同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入Phylip3.6软件包，以简约法构建系统发育树。使用Kimura2-parameter法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap）500次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23SrDNA的拷贝数相同。16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。细菌的16SrDNA的结构如下：图6-116SrDNA的结构可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将5¡¯V1V2V3V4V5V6V7V8V9V103’540bp970bp1540bp16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，和其他方法相比，16SrDNA序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。27f－1492r细菌16SrDNA基因的V3区引物,通用引物F341（5’CCTACGGGAGGCAGCAG3'）和R518(5'ATTACCGCGGCTGCTGG3')16SrDNA基因序列的扩增采用细菌通用引物正向引物5AgAgTTTgATCATggCTCAg-3反向引物5-ggTACCTTgTTACgACTT-3