生物化学实验指导

生物化学实验指导主编：朴金花副主编：江旭东李晶编辑委员会：王昭欧芹张涛张鹏霞白大芳杨晶王跃新王明富鲁燕李志伟江旭东李晶朴金花目录第一部分生物化学技术概论1.实验记录和实验报告的书写…………………………………………………2.普通实验技术…………………………………………………………………3.实验样品的制备………………………………………………………………4.离心分离技术原理及使用方法………………………………………………5.电泳原理………………………………………………………………………6.分光分析原理…………………………………………………………………7.层析分离原理…………………………………………………………………8.实验室规则…………………………………………………………………第二部分生物化学基本实验实验一维生素C的定量测定…………………………………………………实验二考马氏亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量…………………………实验三蛋白质紫外分光测定法……………………………………………实验四血清脂蛋白琼脂糖电泳………………………………………………实验五血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳……………………………………实验六血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳……………………………………实验七pH对唾液淀粉反应速度的影响………………………………………实验八碱性磷酸米氏常数的测定……………………………………………实验九改良Mohun法测定血清谷-丙转氨酶活性…………………………实验十氨基转移作用…………………………………………………………实验十一离子交换层析分离混合氨基酸……………………………………实验十二胡萝卜素的柱层析分离……………………………………………第三部分生物化学综合实验实验十三脲酶凝胶过滤分离……………………………………………………实验十四血清蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳………………………实验十五质粒DNA的微量快速提取…………………………………………实验十六多聚酶链式反应（PCR）技术………………………………………实验十七蛋白质印迹分析（WesternBlot）……………………………………实验十八碱性磷酸酶比活性测定………………………………………………实验十九四唑盐比色法（MTT）法………………………………………………实验二十核酸的提取、定量测定………………………………………………实验二十一肝糖原提取与鉴定……………………………………………………第一部分生物化学概论本部分的内容为生物化学实验中所涉及的主要原理。介绍如何正确记录实验过程及书写实验报告的一般规则，是训练学生进行正规实验寻林的重要内容。普通实验技术包括玻璃仪器的洗涤，洗液的配制，吸量管的使用、混匀的方法以及过滤、离心等一般实验室技术。实验样品的制备着重讨论在生物化学实验中，血液、尿液样品及组织材料的采集和处理，匀浆制备和组织浸出液制备。离心分离技术、电泳原理、分光分析、层析分离技术，重点讨论这些重要技术的原理，内容则尽可能简洁扼要，作为具体实验内容的参考。一.实验记录和实验报告的书写实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过实践掌握科学观察的基本方法和技能，培养学生科学思维、分析判断和解决实际问题的能力。也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，培养科学态度的重要环节。（一）实验记录记录实验中观察到的现象、结果和数据，及时地记录在激烈路本上。原始数据必须准确简练、详尽、清楚。记录时不能夹杂主观因素，在定量实验中观测的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光密度值等，都应设计一定的表格，依据仪器的精确度记录有效数字。完整的实验记录包括实验日期、实验题目、目的、操作、结果。（二）实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列顺序写出实验报告：1.实验名称（Thetitleofexperiment）：2.目的（Objective）：3.原理（Principle）：最好使用简式。4.操作步骤（Operationalprocedure）：5.实验记录6.计算与结果（CalculationandResults）：7.讨论（Discussion）：对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。操作者姓名，实验日期。二、普通实验技术（一）玻璃仪器的洗涤与清洁玻璃仪器的洗涤与清洁直接影响实验结果的准确性，因此玻璃仪器的洗涤工作是很重要的1.新购置玻璃仪器的清洗新购置来的玻璃仪器表面附着有游离碱质，应先用肥皂水洗刷后再用流水冲洗，浸泡于I－2％HCl中过夜，取出后再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2－3次，在干燥箱中烤干或自然晾干，备用。2.使用过的玻璃仪器的洗涤·（1）一般玻璃仪器：烧杯、三角烧杯、试剂瓶、试管等，可先用洗衣粉或肥皂水刷洗，将器皿内外壁细心地刷洗，使其尽量多地产生泡沫，然后再用自来水洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗2－3次，晾干备用。（2）容量仪器：吸量管、容量瓶、滴定管等在使用后立即用清水冲洗，勿使粘污物质干涸，并及时用流水或洗衣粉水尽量洗涤，稍干后有铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗，将洗液完全洗去，最后用蒸馏水冲洗2—3次，晾干备用。（3）比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗干净，如不干净时可用HCl或适当溶剂冲洗（避免用较强的碱液或强氧化剂清洗），再用自来水冲洗干净。切忌用试管刷或粗糙的布或纸擦洗，以保护比色杯透光性，冲洗后倒置晾干备用。（二）清洗液的原理与配制1.肥皂水，洗衣粉溶液和去污粉：是常用的洗涤剂，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白质及其它粘着性物质溶解或松弛，一般玻璃仪器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。2.铬酸洗液（1）原理：铬酸洗液由重铬酸钾（或重铬酸钠）和浓硫酸配制而成,其清洁效力主要应用其强氧化性和强酸性。K2Cr2O7+H2SO4→H2Cr2O7+K2SO4↓2CrO3(铬酐，红色)+H2O↓Cr2O3（绿色）+3（O）H2SO4→H2O+SO2+（O）铬酐越多硫酸越浓，其清洁效力也就越强，当洗液变绿色后则不宜应用。洗液的配制：称取重铬酸钾5g放于250ml烧杯中，加热水5ml搅拌，使其尽量溶解，烧杯下垫一一石棉网以防过热，然后慢慢加入工业用浓硫酸100ml随加随搅拌，尽量避免红色铬酐沉淀析出。此时洗液由红黄色转为黑褐色，冷却后储存于指定容器内，盖紧以防吸水，贴上标签（洗液变绿后不宜使用）。3．使用：使用洗液前需将玻璃仪器用自来水冲洗数次，并将仪器上的水分尽量除去再放洗液中浸泡，数小时后取出仪器，用自来水充分清洗至无水分为止，冲洗时注意勿将洗液溅出水槽，再用少量蒸馏水冲洗数次，晾干备用。上述两种洗液时常用的，实验中遇到特殊污染物，需用针对性强的洗涤液。（三）量器类的使用法量器是指对液体体积进行计量的玻璃器皿，如滴定管、移液管、容量瓶、量筒、刻度吸量管、刻度离心管及自动加液管等。l.滴定管：滴定管分常量与微量滴定管。常量滴定管又分为酸式与碱式两种，各有白色、棕色之分。酸式滴定管用于盛装酸性、氧化性以及盐类的稀溶液。碱式滴定管用来盛装碱性溶液。棕色滴定管用于盛装见光易分解的溶液。常量滴定管的容积有20、25、50、100毫升四种规格。微量滴定管分为一般微量滴定管和自动微量滴定管，容积为5、10g升等规格，刻度精度因规格不同而异。滴定管主要用于容量分析。它能准确读取试液用量，操作比较方便。一般是左手握塞，右手持瓶；左手滴液体，右手摇动。在滴定台上衬以白纸或者白磁板，以便观察锥形瓶内的颜色。滴定速度以10ml/min，即每秒3～4滴为宜。接近终点时，滴速要慢。甚至每秒半滴或l／4滴地进行滴定，以免过量。达到终点后稍停l～2分钟，等待内壁挂有的溶液完全流下时再读取刻度数。正确读取容积刻度是减少容量分析实验误差的重要措施。滴定管的读数方法，可依个人的习惯而不同。但是在同一实验中读取容积刻度时，必须以液面的同一特征标志为准，以保证其系统误差。一般读数方法∶普通滴定管读取数据，双眼与液面同水平读数。有色液读取数据是溶液弯月面两侧最高点连线与刻度线重合点°无色液读取数据是溶液弯月面最低点水平线与刻度线重合点。2．吸量管可淮确地量取溶液的体积。（1）分类：常用分三类：①奥氏吸量管：供推确量取0．5毫升、l毫升、2毫升液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放液时必须吹出量后残留在吸量管尖端的液体，主要用于量取粘滞系数大的液体。②移液管：供推确量取5毫升、10毫升、25毫升等较多体积液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放出液体流毕后，将吸量管尖在容器内壁上继续停留15秒，注意不要吹出尖端最后的部分。③刻度吸量管：供量取10毫升以下任意体积的液体时用。分全流出式与不完全流出式。全流出式：一般包括尖端部分，欲将所量取液体全部放出时，须将残留管尖的液体吹出。此类吸量管的上端常标有吹字。不完全流出式：若吸量管上端未标有吹字样，则残留管尖的液体不必吹出o其刻度不包括吸量管的最后一部分。（2）吸量管的使用①选择：使用前先根据需要选择适当的吸量管，刻度吸量管的总容量最好等于或稍大于最大取液量。临用前要看清容量和刻度。②执管：用拇指和中指（辅以无名指），持吸量管上部，用食指堵住上口并控制液体流速，刻度数字要对向自己。③取液：用另一只手捏压橡皮球，将吸量管插入液体内（不得悬空，以免液体吸入球内），用橡皮球将液体吸至最高刻度上端l～2cm处，然后迅速用食指按紧管上口，使液体不致于从管下口流出。④调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大的液体（如：全血、血清、血浆）时；先用滤纸擦干管尖外壁，然后用食指控制液体缓慢下降至所需刻度（此时液体凹面，视线和刻度应在同一水面上），并立即按紧吸量管上口o⑤放液：放松食指，使液体自然流入受器内。放液时，管尖最好接触受器内壁。但不要插入受器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。⑥洗涤：吸血液、血清等粘稠液体及标本（尿液）的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净。吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后再冲洗。冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。3.容量瓶用于配制一定浓度标准溶液或试样溶液。颈上刻有标线，表示在20℃，溶液装至标线的容积。有10、25、50、100、250、500、1000、2000毫升几种规格，并有白色、棕色两种颜色。使用方法：使用前应先检查容量瓶的瓶塞是否漏水，瓶塞应系在瓶颈上，不得任意更换。瓶内壁不得挂有水珠，所称量的任何固体物质都必须先在小烧杯中溶解或加热溶解，冷却至室温后，才能转移到容量瓶中。4.量筒量简是用来量取要求不太严格的溶液体积的。在配制要求不太准确的溶液浓度时，使用量筒比较方便。它有从5～2000ml十余种规格。用量筒量取液体体积是一种粗略的计量法，所以，在使用中必须选用合适规格，不要用大量筒计量小体积，也不要用小量筒多次量取大体积的溶液。读取刻度的方法与容量瓶和滴定管相同。（四）一般操作法1.溶液的混匀样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染，严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。溶液稀释时也须混匀。混匀的方法通常有以下几种：⑴搅动混匀法：适用于烧杯内溶液的混匀。如固体试剂的溶解和混匀。搅拌使用的玻璃棒必须两头都圆滑，棒的粗、细、长、短必须与容器的大小和所配制的溶液的多少呈适当的比例关系。搅拌时必须使搅棒沿着器壁运动，以免搅入空气或使溶液溅出。倾入液体时必须沿着器壁慢慢倾入，以免产生大量气体，倾倒表面张力低的液体更要缓慢仔细。研磨配制胶体溶液时，搅棒沿着研体的一个方向进行，不要来回研磨。⑵旋转混匀法：适用于锥形瓶；大试管内溶液的混匀。手持容器使溶液作离心旋转．以手腕，肘或肩作轴旋转。⑶指弹混匀法：适用于离心管或小试管内溶液的混匀。左手持试管上端，用右手指轻轻弹动试管下部，或用一只手的大拇指和食指持管的上端，用其余三个手指弹动离心管，使管内的液体作旋涡运动⑷振荡混匀法：适用振荡器使多个试管同时混匀，或试管置于试管架上，双手持管架轻