QX200软件使用指南

QX200软件使用指南（以英文原版操作手册为准）1.打开电脑中的QuantaSoft软件，如果QX200DropletReader仪器已开启且连接正常，会在软件界面的右上方出现“InstrumentRoutines”的面板，其中“Prime”和“FlushSystem”两项用于日常维护（其他不常用），“Prime”用于更换ReaderOil或者一周以上未用仪器再次使用前用ReaderOil重新填充管路，“FlushSystem”建议在每天第一次实验前运行清洗下管路和取样针。注：仅当仪器中放入PlateHolder时以上命令才能运行。2.软件使用主要分为三步，如界面左边的导航条所示，“Setup”用于设定实验布局，提供96孔板中对应位置的样品、assay及实验类型信息；“Run”指导QX200DropletReader运行微滴检测；“Analyze”分析结果，计算核酸浓度等。软件可能用到的文件类型有：*.qlt文件为用户定义的板面布局文件（不含数据结果）；*.qlb文件为每个设定孔的原始数据文件（未经分析）；*.qlp文件为对设定的板面分析后的数据结果文件；*.csv文件为数据结果输出文件，可用Excel等打开查看。3.Setup点击导航条中的“Setup”，从软件界面左上方的“Setup”面板中可以新建布局（TemplateNew），导入布局（TemplateLoad）或者导入已经完成实验和分析的结果文件（PlateLoad），均可以另存为（SaveAs）至其他路径。注：默认布局文件存储于安装盘如C:\QuantaLife\Templates目录下，默认数据结果文件存储于安装盘如C:\QuantaLife\Data目录下。4.WellEditor在软件界面下方选择要编辑的孔，单击操作为选中孔（显示为灰色背景），可按住“Ctrl”或“Shift”进行多选，也可点选行列号选择一行或一列，或者点击左上角的“*”号选择整板；双击操作为调出孔编辑器（WellEditor），同时显示出选中孔内已编辑的内容（未编辑为空）。如下图所示，输入样品名称，选择实验类型（ABS、RED或CNV），选择使用的Supermix类型，分别输入Target1（对应FAM通道即Ch1）和Target2（对应HEX/VIC通道即Ch2）中的目标基因名称、样品类型。其中样品类型包括：Unused—未使用；Unknown—未知样品；Reference—参照基因；Positive—阳性对照；Negative—阴性对照；Blank—无样品（不会被分析）；NTC—无模板对照编辑或者改动孔信息完成后，注意WellEditor中的Apply方框内是否都打上√，只有打上√的点击下方“Apply”按钮才会有效，完成后点击“OK”保存改动并退出WellEditor。注：实验完成后仍然可以返回“Setup”界面修改已完成实验的孔内信息以重新分析；AutoInc的框内打上√会在写入的name后自动添加此孔编号如RPP30变为RPP30A05；AppliedWellSettings中可以预览编辑好的内容；Ctrl+C、Ctrl+V可以复制一个孔信息至另外一个孔，Ctrl+Z可以返回上一步操作。5.ExperimentEditor在上面的WellEditor中SampleName下的Experiment下拉菜单中可以选择已有的实验类型，或者通过点击“addexperiment…”修改、删除已有实验类型或新建一个类型并命名，调出的面板如下，双击右边框内已有的实验类型名称可以修改或删除（Remove），新建类型直接在Name框内输入新名称，并在下方选择三种类型（绝对定量ABS，稀有事件检测RED，拷贝数变异CNV）之一。注：仅当实验类型为CNV时才会有ReferenceCopies设定项出现，输入的数字代表参照基因在一个基因组中的拷贝数目。可以对实验类型做注释（Comments），设置类型标示的前景色和背景色，完成后点“Apply”使改动生效，点击“OK”保存并退出ExperimentEditor面板。6.Run参照基因拷贝数设定仅出现在CNV实验类型中设置实验类型标示的前景色和背景色对反应孔板信息编辑完成后即可以点击导航条中的“Run”，对检测顺序和检测荧光组选择确定后，QX200DropletReader开始针对已编辑的孔逐个收集检测信号，期间每一步都会自动清洗吸样头，避免交叉污染。运行中左边导航条会有绿色圆点闪现（Runindicator），板面中正在被检测的孔也会被高亮显示，软件上方也会实时显示两个通道的信号收集情况（无论是单通道还是双通道实验均会同时显示散点图和频率分布图），并显示初步计算的浓度值，全部运行完成后会重新分析数据。7.Analyze可以直接对运行完毕的结果进行分析，也可从“Setup”窗口导入一个plate（*.qlp）文件再点击“Analyze”进行分析。结果分析界面主要分为三块：Wellselector—可选择要查看的孔；Resulttable—按设定顺序显示选择孔的各通道结果数据（注意status状态栏信息），重新选择多个孔时需点击“Update”更新显示内容，可“export”结果生成.csv文件；Graphicaldatadisplay—显示选定孔的各种图形化数据结果，下面重点介绍。7.1查看通道数据（1DAmplitude）点击“1DAmplitude”，根据在WellSelector中选择不同可以查看单孔或多孔（见下图）的结果，Graphicaldatadisplay左边显示双通道或单通道检测微滴散点图，横坐标代表微滴数，纵坐标代表荧光强度，阴性微滴以灰色显示，阳性微滴以颜色显示（默认Ch1蓝色，Ch2绿色），若选择“heatmap”视图则根据微滴密度显示不同颜色。Graphicaldatadisplay右边显示双通道或单通道检测微滴频率分布图，横坐标代表荧光强度，纵坐标代表微滴数，故荧光强度较低的左边一簇对应阴性微滴，荧光强度较高的右边一簇对应阳性微滴。阴阳性微滴的判定是由荧光阈值大小决定的，软件会自动计算阈值（AutoAnalyze）并判定阴阳性，但有时根据实验情况会有计算误差甚至无法设定阈值，这时就需要手动设定阈值。使用单孔阈值工具点击散点图中某单孔内合适位置可出现粉色水平阈值线，或者在SetThreshold区域输入数值设定阈值线；选择多孔并同时设定阈值时，使用多孔阈值工具点击散点图中选定孔内合适位置出现粉色水平阈值线，或者在SetThreshold区域输入数值设定阈值线。设定好的阈值线上方为阳性微滴，下方为阴性微滴。阈值在下面的2DAmplitude视图中也可以进行设置。7.2查看散点聚类图（2DAmplitude）点击“2DAmplitude”查看Ch1vs.Ch2的聚类散点图，横坐标及纵坐标分别代表两个通道的荧光强度值，可以点击“AutoAnalyze”进行自动阈值计算，也可通过十字分类工具将图像分为四个象限，自然将微滴分为四类，分别代表Ch1+/Ch2-、Ch1+/Ch2+、Ch1-/Ch2-和Ch1-/Ch2+。另外也可通过十字工具右边的矩形选择工具、椭圆形选择工具和自由选择工具结合下方的聚类类型选择工具进行阴阳性微滴的自定义。7.3查看浓度数据（Concentration）点击“Concentration”查看浓度数据图，显示的内容可以根据选择的不同来调整，浓度数值点上会显示Poissonerrorbar（默认按泊松分布95%置信度计算并显示，可在图左上方Options中点选Use68%更改置信度减小errorbar范围），鼠标放于数值点上可出现具体信息，孔内信息编辑完全一样的重复孔可以通过点选图下方的“merged”合并为一个数据并可显示totalerrorbar和Poissonerrorbar。7.4查看拷贝数结果（CopyNumber）当实验类型选为CNV时此处“CopyNumber”按钮方可点击（否则为灰色不可点状态），可查看选定孔的目的基因在一套基因组中的拷贝数，即用目的基因浓度数据除以参照基因浓度数据再乘以实验类型中设定的参照基因拷贝数所得的结果，同样这里也显示泊松置信区间信息。空心圆表示单孔数据，实心圆表示合并孔（merged）数据。7.5查看比率数据（Ratio）点击“Ratio”按钮查看选择孔内的比率数据，若上方选项中选择了“Ratio(a/b)”表示显示的是Ch1样品/Ch2样品的浓度比率，或者选择“FractionalAbundance(a/a+b)”表示Ch1样品占总样品浓度的百分比，勾选“Inverse”选项后可以分别查看b/a以及b/a+b的结果。7.6查看事件数（Events）点击“Events”按钮查看所选择的样品中各通道检测到的阳性（pos）、阴性（neg）和总（total）微滴数，单个样品内总微滴数是检验此次实验好坏的一个指标，数目一般平均在12000以上，若数目小于10000，则该样品表格结果中的status为“CHECK”状态，只能手动分析阈值，如有必要需重复此次实验。