快速体外分离、长期培养人Th17细胞

快速体外分离、长期培养人Th17细胞方法1.Subject全血2.CD4+T细胞浓缩采用RosetteSep（StemCellTechnologies，Canada）进行阴性选择得到浓缩CD4+T细胞。建立标准密度梯度离心，分离出淋巴细胞3.CD4+T细胞刺激将浓缩的CD4+T细胞悬浮在RPMI1640培养基中（Sigma），包含青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺，HEPES缓冲液和10%小牛血清（R10），浓度为1×106个细胞/ml.含3×106个细胞的3mlR10，在15mlFalcon管中，用每毫升含4μL（1mg/ml）PMA和2μL（1mg/ml）伊沃诺霉素（AGScientific，SanDiego，CA）的细胞溶液刺激。继而加入总量3μL的包含CD49d（1mg/ml）和CD28（0.5mg/ml）的共刺激抗体（BDBiosciences）。随后细胞在37℃、5%CO2条件下孵化3个半小时。阴性对照采用相似方法，但用R10替换PMA和伊沃诺霉素。为了用细胞内细胞因子标记法测量IL-17产量，浓缩的CD4+T细胞用10μLBrefeldinA（1mg/ml）刺激。4.IL-17捕捉复合物的准备IL-17捕捉复合物由2个生物素标记的抗体组成，2个抗体通过一个抗生物素蛋白分子连接。直接连在T细胞表面CD45分子的抗体与IL-17抗体配对。2μL生物素标记的CD45抗体（cloneH130）（Caltag，Invirtrogen，CA）和20μL生物素标记的IL-17抗体（0.5mg/ml）（clone：eBio64DEC17）（ebiosciences，CA）混合加入eppendorf管，并彻底漩涡。然后，加入2μL未作标记的5mg/ml的生物素（Invitrogen，CA），并立即充分混匀。复合物在室温下孵化10分钟，使用前再次漩涡。5.IL-17体外捕获分析被刺激过的细胞用含有2%小牛血清（2%FCS/PBS）的冰冻PBS（Cellgro，Mediatech，VA）,冲洗，以500×克离心10分钟成小球，上清液被完全吸出。然后细胞被悬浮在100μL2%的FCS/PBS，将20μL捕获的IL-17复合体加入。冰上孵化15分钟后，加入9mlR10。将试管放入转动器，在37℃和5%CO2条件下额外孵化1个半小时。6.IL-17+细胞分选被捕获的IL-17细胞可以用2种技术分选：一种是FACSAria细胞分选器（BD），另一种是磁珠技术（Miltenyi，Germany）。FACSAria细胞分选器，细胞被一种太平洋蓝活性胺标记来区分活的和死的细胞。然后用FACS/PBS冲洗细胞，细胞表面用10μL的CD3-FITC，5μL的CD4-Alexa700（BDBIOsciences）和20μL（0.25μg）IL-17A-PE（clone：eBio64CAP17）抗体标记。细胞在暗室诗文条件下孵化15分钟，分析前用2%FCS/PBS冲洗一次。磁珠法捕获的细胞用IL-17A-PE标记15分钟。用2%FCS/PBS冲洗一次将多余的抗体移除，然后参看说明将细胞在4℃条件下加抗-PE磁珠孵化。简而言之，再次冲洗细胞并使之悬浮在500μL缓冲液中。悬浮液用洗液管加入MS柱（Miltenyi，German）并放到磁体上，用500μL的PBS洗3次。将虑柱从磁体上拿下，被选择的细胞收集在一个15mL的Falcon管。被选择的细胞再次通过磁性分离进一步浓缩。Aria分选或磁珠净化得到的Th17细胞，培养在包含50单位的人IL-2（NIH/Roche，switzerland）(R10-50)的R10培养基,.2天后，细胞被250.000照射feeders（3000rad）和抗-CD3/抗-CD8双特异性单克隆抗体（1μg）刺激。每3周细胞被照射feeders（3000rad）和抗-CD3/抗-CD8双特异性单克隆抗体再刺激。培养基每2-3天更换一次。