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1三、《环境微生物学》和《大气污染控制工程》部分实验一水中细菌总数的测定一、目的要求l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2．了解水源水的平板菌落计数的原则。二、基本原理本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、器材l．培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。2.仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。3.玻璃器皿的洗涤和灭菌3.1玻璃器皿的洗涤①新购置的玻璃器皿，因含游离碱，应先在此2%盐酸中浸泡数小时，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1-2次并沥干。②培养细菌的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用热肥皂水或洗涤剂洗刷残渍，再用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1-2次，沥干。③洗涤剂吸管量，可先置3%来苏液内浸30min或高压政策蒸汽灭菌，再用洗涤剂洗涤，用清水及蒸馏水冲洗干净。④洗涤染色瓶时，可在5%漂白粉中浸泡24h后，再用常规方法洗涤干净。⑤含油脂的玻璃器皿，应单独高压灭菌洗涤，趁热倒出污物，置100℃干燥箱内烘0.5h，再放入5%碳酸氢钠水中煮沸，先去脂再行常规洗涤。3.2玻璃器皿的灭菌（1）高压蒸汽灭菌2这是应用研究最广泛的灭菌方法，灭菌是用高压蒸汽灭菌锅进行。手提式高压蒸汽灭菌器，使用方便，其操作方法主注意事项如下：①打开锅盖或从加入口处向锅内加入适量的水。②加水后，将待灭菌器皿放入锅内，不要塞得过紧，以使锅内温度均匀，再将锅盖盖好，拧紧螺旋，使其密封。③打开放气阀，打开热源加热至水沸腾，让锅内冷空气充分逸出。否则锅内温度达不到压力表所指示的对应温度，灭菌不彻底。当冷空气由排气孔排尽后，再关紧放气活塞。等锅内蒸汽压上升至所需压力时，控制热源，维持所需时间，一般为0.10343MPa(121℃)表压，保持20min。④灭菌完毕，关闭热源，必须待压力自然降至“0”时，方可启盖取出灭菌物品，否则易发生危险。（2）干热灭菌实验室中常用的还有热空气灭菌的方法，即将洗干净的待灭菌器皿均匀放入恒温干燥箱内，便不得与内层底板直接接触。关闭箱门，开户电源开关，用恒温调节器，使温度上升至160-170℃，维持2h，即可达到灭菌目的。灭菌完毕后，需关闭电源开关，待温度降至50℃以下时，方可开门取物，否则玻璃器皿可因骤冷而爆裂。4.培养基的制备配制一般培养基的主要程序可分为：调配、溶化、调节Ph、澄清过滤、分装、灭菌、鉴定等步骤。①调配：按培养基配方准确称取各成分，用少量水溶解。对于肉膏之类粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿中称量，然后加水移入培养基中。此外，也可放在称量纸上称量后直接放入水中，这时如稍微加热，肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨等极易吸潮物质，在称取时动作要迅速。此外，维生素、氨基酸、无机盐等微量成分，可预先配制高深度的贮备液，在配制培养基过程中再按配方比例取一定量加入培养液中即可。②融化：将各成分混匀于水中，最好以流通蒸汽融化0.5h，如在电炉上融化应随时搅拌，如有琼脂成分时，应注意防止外溢。融化后，应注意补充失去的水分，补足至原体积。3制备大量培养基时，除玻璃器皿外，还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热融化，但不可用锅或铁锅，以免金属离子进入培养基中影响细菌生长。③调节pH值：一般细菌用的培养pH调整在6.8-7.2之间，但也有需要酸性或碱性的培养基。培养基高压灭菌后，pH值约降低0.1-0.2，故调节时应比实际需要的pH值高0.1-0.2。但有时也可降低0.4，因所使用的灭菌器不同而不同。调节pH值，用盐酸和氢氧化钠，因为在相同pH值下，有机酸比无机更易抑制微生物生长，因此，除非特殊情况，最好不要用乙酸等有机酸来调节pH值。一般用精密pH试纸调节（精确到0.1pH单位），必要时也可酸度计。调节时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。④过滤澄清：培养基配成后，一般都有沉渣或混浊，需过滤，使其清晰透明方可使用。液态培养基常用滤纸过滤；固态培养基如琼脂培养基，加热后需趁热用脱脂棉或多层纱布过滤。⑤分装：将调节pH值后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。分装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌。基础培养基一般常分装于三角瓶内，分装的量应根据使用目的和要求决定，但必须定量分装，以便灭菌后使用。琼脂斜面分装量为试管容量的1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3。半固体培养基分装量约占试管长度的1/3，灭菌后趁热直立，待冷却凝固。高层琼脂分装量约为试管长度的1/3，灭菌后直立凝固待用。琼脂平板是将灭菌后的培养基，冷却至50℃左右，在无菌条件下倾入灭菌平皿内。内径9cm的平皿倾注培养基约15ml左右，使培养基平铺于皿底部，凝固后即成。倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。新制成的培养平板，表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣置于37℃培养箱内约30min，待平板干燥后使用。⑥灭菌：加热配制培养基后，在2h内进行了灭菌处理。不要把未灭菌的培养基冷藏或存放。绝大多数培养基都应放在高压灭菌器内于121℃灭菌，并应在达到这一温度后持续15min。糖类液态培养基或含有其他特殊成分的培养基，4高压蒸汽灭菌会使其分解，一用滤膜过滤灭菌。或者将不耐热物质用其他方法灭菌（如流通蒸汽灭菌）后，再加入已灭菌的培养基中。⑦保存：配制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤配制为宜。每批应注明制作日期。已灭菌的培养基可在4-10℃存放1个月。存放时应避免阳光直射，并且要避免杂菌浸入和液体蒸发。当发酵管中的液体培养基存放在冰箱或者适中的低温时，可能有空气溶解进去，以致在37℃培养时，会在管内形成空气泡。因此，凡存放在低温的发酵管，使用前应先予以培养过夜，弃去有气泡的管子。液态培养基在室温下存放超过一周，可能有水分蒸发，如果管内液体损失10%，应弃去不用。5.各种培养基的成分与制备为减少配制中的误差，尽量选用市售已配好的综合培养基。（1）营养琼脂培养基蛋白胨10ｇ牛肉浸膏3ｇ氯化钠5ｇ琼脂15-20ｇ蒸馏水1000ml将上述成分混匀后，调节pH为7.4-7.6，过滤去除沉淀，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌15min，贮存于暗处备用。（2）乳糖蛋白胨培养液蛋白胨10ｇ牛肉浸膏3ｇ氯化钠5ｇ乳糖5ｇ1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml蒸馏水1000ml将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氧化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2-7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min，贮于暗处备用。5此培养基适用于检验大肠菌群时作发酵试验用。根据实际需要，也可按上述配方比例（除蒸馏水外）配成二倍、三倍或五倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。（3）品红亚硫酸钠培养基（多管发酵用）蛋白胨10ｇ乳糖10ｇ琼脂20-30ｇ磷酸氢二钾3.5ｇ无水亚硫酸钠5ml蒸馏水1000ml5％碱性品红乙醇溶液20ml①贮备培养基：先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，渴匀使其溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调节pH为7.2-7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min。贮于暗处备用。②平板培养基：将上述贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1：50的比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中；再按1：200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡红色为止（不宜多加）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此种培养基适量（约15ml）倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。（4）伊红美蓝培养基（ERB培养基）蛋白胨10ｇ乳糖10ｇ琼脂20ｇ磷酸氢二钾2.0ｇ蒸馏水1000ml2％伊红（曙红）水溶液20ml0.5％美蓝（亚甲基蓝）水溶液13ml①贮备培养基：先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，渴匀使其溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调节pH为67.2-7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽器中，在115℃高压蒸汽灭菌20min。贮于暗处备用。②平板培养基：将上述贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的2％伊红水溶液及0.5％美蓝水溶液加入已融化的培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。当混合好的培养基冷却至45℃，便立即将此种培养基适量（约15ml）倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。四、操作步骤l．水样的采取(1)自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。(2)池水、河水或湖水：应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存2．细菌总数测定(1)自来水①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。④培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。(2)池水、河水或湖水等①稀释水样：取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。7一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。3．菌落计数方法(1)先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。(2)首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。(6)若所有稀释度的平均菌落