第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定

第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一N-端fMet或Met的切除二硫键的形成化学修饰剪切泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关第一节蛋白质翻译后修饰的鉴定一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶“活性”对外界信号具有级联放大作用蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应磷酸化类型丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸和谷氨酸的酰化丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化=1800：200：1被磷酸化修饰的蛋白改变所带的电荷改变催化基团的性质改变蛋白质的构象改变蛋白质的亚细胞分步蛋白质功能变化的多样性蛋白质磷酸化研究有三个主要目的(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白质在体内的磷酸化氨基酸残基定位(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶(3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响二、磷酸化蛋白质分析的概述磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术之一细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难,一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量的10%磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中二、磷酸化蛋白质分析的概述体外pmol体内fmol32p蛋白标记32p细胞标记蛋白质分离蛋白酶切蛋白酶切2DPP作图2DPP作图μLC－ESI-MS或MALDI-MSμLC－ESI-MSμHPLCIMAC磷酸氨基酸分析相关分析二、磷酸化蛋白质分析的概述双相磷酸多肽谱图2D—PP多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷酸化状态的重要信息(1)磷酸化位点的最大数目(2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸化的相对化学计量(3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性的相对状态二、磷酸化蛋白质分析的概述磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化肽段的信号强度要低很多磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白鉴定要困难的多三、磷酸化蛋白质的检测32P放射性标记法抗体免疫印迹检测法1、32P放射性标记法32P放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化蛋白质培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化局限性磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质不能标记组织样本放射性污染2、抗体免疫印迹检测法通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反应(Westernblotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用的方法在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有空间障碍,所以抗体的结合力较差免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）制备型2D胶电泳分析型2D胶电泳考马斯亮蓝染色转印到膜找出相应的磷酸化蛋白质磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质染色—得到全部蛋白质点磷酸化蛋白质鉴定图谱比较四、蛋白质磷酸化位点的分析1、磷酸肽的分离和富集分离浓缩分析物，提高信噪比如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测和分析低丰度磷酸肽1、磷酸肽的分离和富集方法反相液相色谱（PR-HPLC）免疫沉淀固相金属亲和色谱金属氧化物/氢氧化物亲和色谱离子交换和等电聚焦免疫沉淀原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来免疫沉淀物固相金属亲和色谱Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMACIMAC柱：金属离子、螯合剂、填料原理：带正电的金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液有机相的影响，在高pH或磷酸盐存在的缓冲液中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷酸肽被释放出来局限性丢失低丰度、没有结合到IMAC柱上的磷酸化肽段具有多磷酸化位点的肽由于较强的亲和力较难被洗脱下来酸性基团（天冬氨酸、谷氨酸）、电子供体（组氨酸）也会结合到柱上，造成非磷酸化肽的污染效果：依赖于所选择的金属离子、填充柱的材料及洗脱程序金属氧化物/氢氧化物亲和色谱Metaloxide/hydroxideaffinitychromatography,MOACTiO2、Al(OH)3、ZrO2TiO2富集磷酸肽原理：TiO2是一种两性物质，由于钛原子和氧原子的原子表面化合价不饱和，TiO2在不同的pH值下可以表现为路易斯酸或路易斯碱在酸性溶液中，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合。磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐都与TiO2具有高度的亲和力，其中TiO2与磷酸盐的结合能力最高调节pH值后，TiO2可用于富集磷酸肽离子交换和等电聚焦离子交换（strongaionexchange,SAX/strongcaionexchange,SCX）:离子强度不同进行分离IEF:等电点不同进行分离主要用于复杂样本的预分离，降低样本复杂程度结合金属亲和等其他富集技术，可取得很好的效果2、磷酸肽的识别质谱技术质谱技术结合磷酸酶水解MALDI-TOFMS可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOFMS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点原理通过MALDI-TOF/TOF一级质谱可发现与肽段分子量理论值相差80Da(HPO3=80Da)的质谱峰,该峰的二级质谱图中如果母离子与旁边的最高强度的质谱峰相差98Da(中性丢失H3PO4=98Da),则可确定该肽段为磷酸化肽段,进一步通过二级或多级质谱的谱图确认具体的磷酸化位点利用β－消除反应使丝氨酸、苏氨酸磷酸化残基转化为氨乙基丙氨酸,后者为赖氨酸的同形物,此位点可被胰蛋白酶和Lys-C肽链内切酶等酶特异性识别、酶切,通过质谱即可很容易地判断磷酸化位点。消除反应是从反应物的相邻碳原子上消除两个原子或基团，形成一个π键的过程1,2–消除反应（β-消除反应）CCRRRRHLCCRRRR+HLL=X,-NR3,-OH2等PSD-MALDI-MS分析源后衰变发生在源内离子化之后的分子裂解MALDI-TOF-MS离子源内发生的离子在真空无电场飞行管飞行过程中发生结构裂解，丢失一个中性分子后产生了碎片离子碎片离子具有与其前体离子相同的飞行速度，但由于质量小，动能比前体离子小（亚稳离子）β－消除反应丢失HPO3或H3PO4，产生数减少80Da或98Da亚稳离子图利用MALDI-TOF/TOF谱图鉴定磷酸化肽段a:酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星号标出,其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移80Da(HPO3=80Da);b:a中标记星号的质谱峰的二级质谱分析。在图中可见比母离子小98Da(H3PO4=98Da)的中性缺失峰串联质谱(MS/MS)前体离子扫描通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在；磷酸化肽经CID（碰撞诱导解离）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”前体离子扫描在三级四级串联质谱采用使各种质荷比的离子依次通过Q1分析器，Q2为碰撞诱导解离室，将Q3分析器的电压和频率设定为只能传输某一特定质荷比，即特定质荷比的子离子直接检测在碰撞诱导解离过程中丢失的碎片离子前体离子扫描分析磷酸肽负离子模式设定Q3中仅能通过的子离子质荷比m/z79，即磷酸肽丢失的PO3-，这样得到的质谱图仅显示丢失m/z79的离子的谱峰丢失磷酸根离子的磷酸肽谱峰多肽产生的各种碎片离子中，质量数在79Da附近的几乎没有中性丢失扫描具有两级质量分析器和碰撞诱导解离室的串联质谱仪Q1和Q2同步扫描，但扫描范围不一样，保持一个特定的电压差值，这个电压差所代表的质荷比m/z值代表一个中性分子的质量将Q1输送来的离子碰撞诱导裂解，再将碎片离子送入Q3只有在Q2中诱导裂解后能丢失这一特定中性分子的离子才会被Q3传输到检测器中性丢失扫描分析磷酸肽从带一个正电荷的[M+H]+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压差所代表的质荷比应为m/z98从带两个正电荷的[M+2H]2+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压差所代表的质荷比应为m/z49只能分析磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸3、磷酸化氨基酸位点的确定用于确定磷酸化肽中磷酸化位点的质谱方法基于两种不同原理第一种方法取决于磷酸酯键的化学稳定性如在ESI质谱仪的碰撞室或离子源中，或在MALDI—MS的源后裂解（PSD）过程中磷酸化肽可通过磷酸酯键断裂产生的碎片离子鉴定第二种方法基于肽段增加的磷酸酯基团的质量数如果蛋白是已知的，可通过质量数来确定肽段在某些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则很容易找到磷酸化位点，但在大多数情况下肽段含有许多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则确定磷酸化位点发生困难五、蛋白质磷酸化的定量分析定量：磷酸化蛋白与其对应的非磷酸化蛋白质的比例研究的蛋白样本酶切后等分成两部分,一部分直接用CH3OH甲酯化,另一部分经过磷酸酯酶处理后用CD3OH甲酯化,随后将两者混合进行串联质谱研究,即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信息该技术设计巧妙,但甲酯化的效率可能会影响定量结果一种基于稳定同位素标记的分析技术SILAC(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture)采用