肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室

1/9生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：南方医科大学2/9生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法；2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法；3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式；4、正确掌握使用离心机的方法步骤；5、熟练运用溶液混匀的各种方法；6、正确掌握溶液转移的操作；7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤二、实验原理实验1肝糖原的提取与鉴定糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分3/9离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=H20+Cu2O↓(红色)Cu(OH)2====H2O+CuO↓(黑色)实验2肝糖原定量测定糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。三、材料与方法：以流程图示意1、实验材料（1）肝糖原的提取与鉴定样品：1.50g的鸡肝试剂：5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂仪器和器材：离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温-100℃恒温水浴箱、4/9剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板（2）肝糖原的定量测定样品：0.15g的鸡肝试剂：30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液显色剂仪器和器材：室温-100℃恒温水浴箱、比色皿、100ml容量瓶、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪3、实验步骤与方法（1）肝糖原的提取与鉴定：鸡肝约1.5g,剪碎+1ml5%三氯醋酸，研磨至乳状+3ml5%CCl3COOH三氯醋酸，研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心5min(4000r/min)上清液(取2ml)沉淀（弃去）离心5min(4000r/min)+2ml95%乙醇，混匀，静置10min沉淀上清液（弃去）沸水浴2min,溶解沉淀5/9图一：肝糖原的提取与鉴定实验流程（2）肝糖原定量测定白瓷板孔穴中糖原溶液1ml加碘试剂2滴糖原溶液2滴加碘试剂2滴蒸馏水2滴呈色对比+浓HCl5滴沸水浴15min,冷却+50%NaOH5滴糖原水解液2滴糖原水解液+班氏试剂4滴混匀沸水浴2min,观察变化鸡肝0.15g，加30%KOH1.5ml沸水浴15分钟糖原的测定冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液6/9图二：肝糖原定量测定试验流程取3支试管，按下表操作。试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0——标准葡萄糖溶液—1.0—糖原提取液——1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5表一：糖原测定试管操作混匀，沸水浴10分钟，冷却至室温。在分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、实验现象实验一：肝糖原的提取与鉴定①所获糖原溶液如下图：图三：所获糖原溶液所获糖原溶液呈乳样光泽。7/9②将糖原溶液滴到碘试剂中可以勉强看到溶液出现浑浊，砖红色沉淀不明显，说明样品鸡肝中糖原含量少。图四：糖原溶液与碘试剂反应③糖原水解液与班氏试剂混合后溶液变深蓝。沸水浴加热2min后，产生浑浊，砖红色沉淀不明显，说明样品鸡肝中糖原含量少。图五：糖原水解液与班氏试剂混合沸水浴后碘液+蒸馏水碘液+糖原溶液沸水浴前沸水浴后8/9实验二：肝糖原的定量测定空白管、标准管和样品管混匀呈现如下颜色反应图六：加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比2、吸光度数据记录：620nm波长吸收度值记录测定次数各管吸光度值A620空白管标准管样品管100.6720.099200.6710.101300.6720.102各管平均值00.6720.101表二：620nm波长吸收度值记录表3、结果计算：根据公式：肝糖原（g/100g肝组织）=11.11000100）肝组织重（10005.0标准样品gAA计算结果得样品肝糖原（g/100g肝组织）=0.56g/100g肝组织故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝糖原，且肝糖原含量为0.56g/100g肝组织。4、结果分析经查阅资料得：饱食鸡肝的肝糖原含量为：2～3g/100g肝组织，而本次实验测得肝糖原=0.56g/100g肝组织，即本次实验测得的肝糖原含量偏低。空白管标准管样品管9/95、讨论总结（1）与碘试剂反应时：加入糖原的孔穴并没有出现预期的明显红棕色。究其原因，在取糖原沉淀时，沉淀很少，糖原含量也很少。而又因为碘试剂本身是黄色的，本来现象就不是很明显，这样一来，几乎看不到反应会产生的红棕色了，说明糖原含量极少。（2）糖原中葡萄糖的鉴定：实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。原因还是糖原含量极少，又加过少量酸与碱，浓度更小，现象更不明显，所以观察不到明显的砖红色。（3）在肝糖原定量测定中，三只试管水浴15min后，标准管颜色最为明显，为绿色，加入的是标准葡萄糖溶液，样品管与空白管颜色依次递减。（4）由资料可知饱食鸡肝糖原含量宜在2～3g/100g肝组织，而本次实验测得肝糖原为0.56g/100g肝组织，偏低。究其原因，实验中操作没有失误，与其他小组和其他实验室对比，发现各小组结果均偏低，可以推测，实验现象不明显原因是鸡肝材料糖原含量偏低。6、结论：本次试验为《肝糖原的提取、鉴定与定量》，通过这次实验掌握了组织样品的制备方法，了解了其注意事项；了解了肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握了其操作方法。巩固了正确操作使用刻度吸管和移液枪。掌握了溶液转移的操操作，复习巩固了正确操作分光光度计。实验中没有错误与过失，结果正常。呈色反应、颜色观察与定量测定都正确成功。