植物基因表达的启动子

一、启动子的结构启动子：位于结构基因5’端上游、能够指导RNA聚合酶同模板正确结合、启动基因转录的一段DNA序列。启动子区增强子区结构基因真核启动子比原核更复杂、序列也更长，它不像原核启动子那样有明显共同一致的序列，而且单靠RNA聚合酶难以起动转录，而是需要多种蛋白质因子的相互协调作用。不同真核启动子之间大小、序列很不相同。不同物种的启动子有时不能互用，如动物和植物之间。•真核启动子中包含了许多调节基因转录的元件，它们控制着基因表达的强弱或者时空差异。根据对基因表达的必须性，这些元件分为2类：核心启动子元件和上游启动子元件（1）TATA框(TATAbox)：位于5′端转录起始点上游约20-30个核苷酸的地方。TATA框是一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为TATAATAA。TATA框是RNA聚合酶的重要的接触点，它能够使酶准确地识别转录的起始点并开始转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA的转录就会从不正常的位置开始。（2）CAAT框(CAATbox)：位于5′端转录起始点上游约70-80个核苷酸的地方。CAAT框是启动子中另一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为GGCTCAATCT。CAAT框是RNA聚合酶的另一个结合点，一般认为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当这段顺序被改变后，mRNA的形成量会明显减少。1.核心启动子元件(corepromoterelement):指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括TATA盒和CAAT盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。11281tttcccgccttcagtttagcttcatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaac11341tcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaaga11401aaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagata11461cagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacc11521tcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaag11581gtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctg11641ccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacg11701ttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatg11761acgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatt11821tggagagaacacgggggactcttgac花椰菜花叶病毒35S启动子=CaMV35S启动子TATA框(TATAbox)CAAT框(CAATbox)2.上游启动子元件(upstreampromoterelement):包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的时间与空间表达调控。这些上游启动子元件中，最普遍的是增强子元件。•3.增强子（enhancer）是一种能够提高同一条DNA链上基因转录效率的顺式调控元件。最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物和原核生物中都发现了增强子。增强子通常长100－200bp，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8－12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点①增强子可以远距离作用。通常可距离1-4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。②增强子作用与其序列的正反方向无关。将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。③增强子要有启动子才能发挥作用。没有启动子存在，增强子单独不能表现活性。④增强子对启动子没有严格的专一性。同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。例如当含有增强子的病毒基因组整合入宿主细胞基因组时，能够增强整合区附近宿主某些基因的转录；当增强子随某些染色体段落移位时，也能提高移到的新位置周围基因的转录。1pCambia-Agl5-iaaM16500bpLBpolyAHygromycin2XCaMV35SKanamycinnosiaaMAgl5lacZ35SPGUSplusnosRBEcoRI(1)XhoI(15500)XhoI(14500)SacI(300)SalI(1430)NcoI(2400)SalI(4500)PstISphIHindIII(4520)NcoI(5200)BglII(5206)NheI(7250)NheI(10650)带增强子的35S启动子4.静止子(silencer)•最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多，但从已有的例子看到：静止子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。1.组成型启动子•可以在所有细胞、组织和器官中持续发挥作用的启动子。如看家基因的启动子。组成型启动子用来控制基因的持续表达，如抗病、抗虫、抗不良环境的基因。•在植物基因工程中，用于控制基因组成型表达的启动子主要有2个来源：微生物和植物。二、启动子的类型1.1病毒来源的组成型启动子—CaMV35S启动子•CaMV35S启动子是花椰菜花叶病毒（cauliflowermosaicvirus，CaMV)双链DNA病毒基因组中启动35SRNA基因转录的启动子，CaMV35Spromoter，它可以利用宿主细胞核RNA聚合酶进行基因转录，并且不依赖于病毒的产物。35S启动子的结构+9-90-343DomainADomainBDomainA:与在根部起作用有关。DomainB：是烟草转录因子ASF-1的结合部位，与在植物叶片、茎等绿色组织中起作用有关。上游部分：与转录强度有关（增强子功能）。含有重复的-343—-90部分的35S启动子比350bp的35S启动子的强度大10倍。35S启动子的核心长度为60bp左右；其上游有其它元件，控制启动子的转录效率和特异性，其中包括增强子。增强子•CaMV35S启动子是一个组成型启动子，不仅可以能在双子叶植物中高效启动基因表达，而且在许多单子叶植物中也可以高效启动基因表达。另外CaMV35S启动子内部没有我们常用的酶切位点，因而容易克隆和使用，在植物基因工程中得到了广泛的应用。35S启动子控制的GUS基因在烟草中表达茎叶片横切面根花幼苗•由于CaMV35S启动子在植物中成功的应用，人们也克隆了其它病毒的启动子，如cassava（木薯）veinmosaicvirus(CsVMV)promoter，Australianbananastreakvirus(BSV)promoters，mirabilismosaicvirus(MMV)promoterandfigwort（玄参）mosaicvirus(FMV)promoter，这些启动子也能够在植物中高效高效启动基因的转录。•利用病毒来源的启动子进行植物转基因有令人担心的问题，如：•转基因食物与感染人类的病毒存在时，启动子可能与病毒基因重组、导致病毒基因的大量表达。•植物细胞可能不识别病毒来源的启动子序列，把它当作外源DNA，对它进行修饰、使它失去作用，导致基因沉默。原核生物组成型启动子之二：农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子NospromoterNospromoter35SpromoterNospromoter烟草卫矛1.2植物来源的组成型启动子•在植物中有很多看家基因，在各种类型细胞和所有时间内都表达。启动这些基因表达的启动子就是组成型启动子。现在许多这类启动子已经被克隆，并在植物基因工程得到了应用。•肌动蛋白（actin）是细胞基本骨架的成分，actin基因家族的基因都是组成型基因，其启动子就是组成型启动子。通过检测报告基因的表达，发现1.5kb的拟南芥actin2基因启动子几乎在拟南芥所有器官和整个发育过程中都起作用，仅在种皮、胚轴、子房和花粉囊中不起明显作用。•水稻的actin1基因启动子仅不在木质部中起作用。拟南芥ACTIN2基因启动子分析•Ubiquitin（泛素蛋白）也是细胞中重要的基本成分，参与了许多重要生命过程，如蛋白质转运、染色质结构、DNA修复等。来自玉米的Ubiquitin1基因的启动子（pUbi）是用得比较多的植物启动子之一，特别是在单子叶植物中，在玉米中pUbi的作用是35S启动子的10倍。•来自烟草的Ubi.U4基因的启动子(-263bp)在烟草中的作用比35S启动子好。2.特异启动子•在基因工程中利用组成型启动子高表达基因常常带来许多麻烦，如影响植物的正常生长发育，转基因植物安全性等问题，所以我们希望在时空上能够控制基因的表达，因此就要用细胞、组织、器官特异启动子。转35S-Kn1-Nos基因的烟草转35S-Kn1-Nos基因的地黄2.1组织特异启动子（tissue-specificpromoter）就是只在特定的组织或者器官（根、叶片、子房、花粉、花原基、种皮等）中起作用的启动子。植物维管组织特异启动子•2.2果实特异性启动子•果实是食用器官，利用果实特异性启动子可以改良果实品质、生产疫苗。•苹果和番茄果实中1-aminocyclopropane-1-carboxylate(1-氨基环丙烷-1-羧酸，ACC)oxidasegene（E8gene）和polygalacturonase(多聚半乳糖醛酸酶，PG)genes启动子在果实成熟是起作用。番茄PG启动子用来提高番茄果实中胡萝卜素的含量；番茄E8启动子表达virus-Fprotein，生产疫苗，提高了老鼠系统免疫能力。2.3种子/籽粒特异启动子•种子/籽粒是很多植物的收获器官，具有重要经济价值，其质量和品质一直受到人们的关注，如食品中蛋白质、油脂、维生素的含量提高、棉花纤维长度的提高、有用物质（蛋白、酶、疫苗的生产等）都可以通过种子/籽粒特异启动子启动有关基因的表达而实现。这类启动子有：•soybeanβ-conglycinin基因启动子在胚成熟的中、后期起作用；sunflowerhelianthinin基因启动子在发育的种子中起作用；Frenchbeanβ–phaseolin基因启动子只在发育的种子的胚乳和胚起作用；cottona-globulin基因启动子可以在棉花、烟草、拟南芥发育的种子中起作用。•种皮特异启动子：Apeaβ-1,3-glucanase基因（PsGNS2）只在种皮中起作用。2.4块根/块茎储藏器官特异启动子•B33andPAT21是土豆的糖蛋白的主要成员，分析表明B33andPAT21基因的表达最主要是在块茎形成的过程中，表明B33andPAT21基因的启动子是块茎特异性的。•Sporamin（红薯特殊贮藏蛋白）andβ-淀粉酶是红薯块根中2个主要的可溶性蛋白，研究表明Sporamin几乎都在块根中表达（1%–4.5%在茎中)。2.5花/花序特异启动子•花是重要的观赏器官，花色、花形、花的寿命和香气等是花卉重要性状。•1.45kb的菊花内源ubiquitinextensionprotein基因启动子(UEP1)在花中的作用是在叶片中作用的9倍，比CaMV35S启动子在菊花中的作用高40–85倍。控制拟南芥花瓣中蜡质合成的基因（